単一細胞のトランスクリプトーム解析

Summary

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。

Abstract

多くの遺伝子発現解析の技術は文化の組織ホモジネートまたは細胞からの細胞の不均一な集団から分離された材料に依存している^。1,2,3の脳の場合には、このような海馬などの領域はそれぞれに、異なる細胞型の複雑な配置が含まれています異なるmRNAプロファイル。単一の細胞を回収する能力は、細胞集団間および内の分子の違いに綿密な調査で、より可能になります。我々は、さらなる処理のために細胞を採取するための簡便かつ迅速な方法を説明します。多くの場合、電気生理学で使用されているピペットは（誤嚥を使用して）目的の細胞を分離し、便利な分子生物学的手法の任意の数のさらなる処理のためのエッペンドルフチュー​​ブに、それを堆積させるために利用されています。我々のプロトコルは、細胞培養または急性スライスからさらには個々の細胞からの樹状突起の収穫に変更することができます。

我々はまた、単一のセルのアイソレーションの主要な下流のアプリケーションとしてaRNAの増幅法を説明します。このメソッドは、逆転写反応またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの他の遺伝子発現解析の手法に代わるものとして私たちの研究室で以前に開発されました^。4,5,6,7,8この手法ではのリニア増幅を提供するポリアデニル化RNAは、材料の唯一のフェムトグラムから始まり、アンチセンスRNAのマイクログラム量で生じる。直線的に増幅された材料は、単離細胞のトランスクリプトームの成分の相対量のPCRの指数増幅よりも正確な推定を提供します。基本的な手順は、増幅の二回で構成されています。簡単に言うと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターのサイトは、mRNA転写物から作成された二本鎖cDNAに組み込まれています。 in vitro転写一晩（IVT）反応は、T7 RNAポリメラーゼは、二本鎖cDNAから多くのアンチセンス転写産物を生成する実行されます。第二ラウンドでは、このプロセスを繰り返しますが、出発原料からいくつかの技術的な違いがアンチセンスRNAである。それは、増幅の3つのラウンドで、その結果、第二ラウンドを繰り返すことが標準です。多くの場合、in vitro転写反応の第三ラウンドは、生成されたアンチセンスRNAをハイブリダイズし、マイクロアレイで検出することができるようにビオチン化ヌクレオシド三リン酸を使用して実行されます^。7,8

Protocol

1。細胞の文化

私たちの研究室では、以下の実験のための主要な神経ラット海馬培養を使用しています。以下は、これらの細胞培養が作成および管理する方法のための修正されたバンカーのプロトコルを説明します^。9これらの細胞の培養技術の組み合わせの網羅的な数と提供する特定の研究室の特定のニーズに合わせた任意の確立された方法は、もちろん、ある細胞の一貫して健康的な供給は適切な代替となります。

1. 五オートクレーブ、ラウンド、12mmのカバースリップを35 mmディッシュに配置されてから、水（細胞培養グレード）でリンスし、80μg/ mLのホウ酸緩衝液O / Nにおけるポリ- D -リジン（MW 70-150,000）でコーティングされていますホウ酸緩衝液O / Nでの1μg/ mLのラミニンでコーティングした後、水で再び洗浄する。 NGメディアは（グルコース（0.6％w / v）の補充したアールの塩とグルタミン、ペニシリン（100 U / mL）を、ストレプトマイシン（100μg/ mL）を、ウマ血清（10％v / v）をMEM）を加え、料理されインキュベーター（5％37 CO _2℃）に保存されます。 PDL150/lamininは、単層として成長する孤立したニューロンのための基質として機能します。カバースリップをメッキする前に2週間程度に被覆することができる。
2. メッキの日に、胎生18日ラット海馬からの一次ニューロンは、100,000細胞/ mLの懸濁液1.5 mLを加えることによってNGメディアでめっきされています。めっき後4〜6時間、各35 mmのディッシュは、任意の混入グリア細胞の増殖を防ぐために、5mMのシトシンβ- D -アラビノフラノシド（ARA - C）0.75μLで扱われます。 24時間後、メッキのメディアは、アールの塩類及びW / Vグルコース0.6％、1mMピルビン酸ナトリウム、及びB27を添加したL -グルタミンとMEMに変更されます。細胞は、プロセスの完全な開発を可能にするためにどんな実験で使用する前に、少なくとも2週間は成長することが許可されています。

2。準備ピペット

RNaseが上の注意：皮膚、唾液、とさえ息がRNaseの主要な情報源、RNAを分解する酵素である。それは、RNaseフリーの技術は、サンプルはRNaseがで汚染され、その後低下しないようにするプロトコルで、この時点から観察されることが不可欠です。これは、常にサンプルや試薬を取り扱う際のサンプルや試薬を介して話を決して、手袋を着用し、滅菌ピペットチップとチューブの新しい箱を使用して含まれています。多くの場合、RNAの仕事のために排他的に指定されていないピペットは、RNaseのAWAY（モレキュラーバイオ製品）のようなRNase処理溶液を用いてそれらを拭くことにより除染されています。それはこれらの治療であなたのサンプルの汚染を防ぐためにも重要であるので、しかし、これらのソリューションは、ダウンストリームの酵素反応を阻害することになります。

1. オートクレーブ1.5ミリメートル外径（OD）ガラスピペット。
2. マイクロピペットプラーを使用して、あなたの引き手、フィラメント、及びピペットに基づいて異なる場合があります電気生理学的記録のための適切な直径、にピペットを引く^。10口径は先端がセルのコレクションの前に壊れてしまうためあまり重要ではない。
3. 慎重にヒントが（理想的にマイクロピペット保存瓶を使用して）そのまま継続される粉塵のない環境でピペットを格納する。
4. 制御された方法で先端を打破するために、片手で指の間に緊張したキムワイプを持ち、非常にゆっくりと紙の1〜2回にわたってピペットの先端を磨きます。開口部は、標的細胞の大きさの約75から100パーセントにする必要があります。あなたが希望する結果が得られるまで、この手順を調整します。

3。準備文化、チューブ、および顕微鏡

1. を1.7 mLエッペンドルフチュー​​ブの必要な数を準備します。材料は、単一セルの増幅、または収穫物の貯蔵用の他のソリューションで使用する場合はPBS、第一鎖の緩衝液2μLを加える。
2. 収穫では、マイクロマニピュレータを搭載した40倍を目的とした光顕微鏡が必要になります。ホルダーから離れて大手フレキシブルチューブとピペットホルダーを使用してください。コレクション中にピペットの不要な動きを防ぐために安定した表面に貼ってチューブを。チューブの終わりには、ルアーロック接続1 mLシリンジは、ユーザー間で接続され、変更できるように針を挿入する。
3. カバースリップを使用している場合、一度にカバースリップで動作します。必要に応じて、*選択肢のPBSまたはメディアを含む新しい35mm皿に、単一のカバースリップを転送する。長い細胞がインキュベーター外の、より多くの不健康な人がなり、そのmRNAプロファイルよりは、健康な細胞のそれから離れることになります。それはそれで機能していないときにインキュベーターでそれらを保つことによって、他のカバースリップ上の細胞の健康を維持することが重要です。インキュベーターの外にあるセルで、可能な限り迅速に動作します。

実際の料理の壁がcoversliに向かってマイクロピペットの適切な進歩を可能にするために高すぎるので*我々のセットアップでは、35 mmディッシュの蓋を使用する必要があります頁

4。収穫セル

1. マイクロピペットホルダーにマイクロピペットを固定します。マイクロマニピュレータのインサートに貼付マイクロピペットホルダー。 40倍の目標を設定します。
2. 顕微鏡ステージ上に皿を置き、収穫に適したセルの領域を見つける。初代神経培養の場合には、細胞は周囲の細胞および/またはプロセスの収穫を防ぐために、その近傍から相対的に分離する必要があります。細胞体とプロセス間のmRNA転写産物の人口は、体細胞のmRNAに興味がある場合などのみ、プロセスと相馬の汚染を防ぐために注意すべきである、異なります。あなたが視野の中心に収穫したいセルを置きます。
3. 光路に皿の解決に向けてマイクロピペットを進めるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。溶液中にピペットチップを下げる。注射器を介して軽く吹いて、この時点から正圧を適用します。接眼レンズをのぞきながら。ピペットは、視野に影のように表示されます。それは粗い焦点ノブを使用してピペット先端のビューとフォーカスのフィールド内になるまでよく細胞の平面の上に、ピペットの先端の位置を調整します。ピペットの内径サイズが大きすぎるまたは小さすぎる場合は、この時点で、それを評価すべきである。練習の収穫は、適切な内径がこの時点で達成されたかどうかを判断する能力を提供します。
4. 今、セルの平面に向かってピペットを進める。それは先端がそれはあなたが収集したいから地域に侵入する原因となって、あまりにも急いで進んでいないようにすることが重要です。これを防ぐために、マニピュレーターを用いて細胞へピペットの先端を進む前に、焦点面を進めるために粗フォーカスを使用してください。細胞とピペットチップの両方がフォーカスになるまでは、セルに近い場合、ファインフォーカスを使用してください。あなたがカバースリップのそれらを吹き飛ばす防ぐために、セルの平面に到達する前に正圧を印加停止します。
5. それはあなたが収穫する細胞体に触れているようにピペットチップを配置するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。
6. 細胞がピペットの先端を入力するまでシリンジを使用して、口の中で穏やかな吸引を適用する。細胞がピペットを入力されていない場合は、カバーから持ち上げまで、そっと近づくのセルと下方向に先端を移動します。

5。セルを保存する

1. すぐにソリューションから抜けたりピペットを移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。
2. ホルダーからピペットを取り外します。
3. 片手には1.7 mLのエッペンドルフチュー​​ブを握り、ゆっくりと底に向かってチューブの側面にピペットの先端を破る。 （0.1 mLのマークを目指す。）
4. チューブの中央に壊れたチップで、ピペットの上部開口部に1〜3 mLシリンジに取り付けられた針を挿入する。急速にチューブ内に噴出するためにピペットで溶液を強制的にプランジャーを押し下げる。セルは、ピペットの非常に先端に残る必要があり、これは正しくセルを追放するために十分なはずです。毛管現象がピペットに液体を戻すことができるように管の側面上の任意の液体に先端に触れないように注意してください。
5. すぐにデスクトップ遠心を用いてチューブの内容物をスピンダウンし、すぐに凍結（-80℃で保存）またはそれ以上の処理（が望ましい）のための氷上に置きます。

6。 aRNAの増幅

1. ラウンド1第一鎖cDNA合成：
   発現/ cDNAのハイブリッドを作成します。
   1. 単一のセルのコレクションのボリュームのすべての5μLのため、コレクションチューブ（氷上で）するには、次の1倍を追加。反応は（10μLコレクションボリューム、などのために2倍）大きいコレクションのボリューム用にスケールアップすることができます。エラーをピペッティングを考慮してコレクションチューブの数を加えた10〜20％以下の試薬を乗じてマスターミックスを作成します。 aRNAのa​​mpificationプロシージャ内のすべての次の反応にこれを行います。
      • ICE ON
      • 1.2μLdNTPの（2.5mMの各）
      • 2.4μL5倍のファーストストランドバッファー
      • 0.3μLT7 -オリゴ（dT）プライマー（100 ng /μLの）
      • 1.2μLDTT（100mMの）
   2. ヌクレアーゼフリー水で10.25μLにボリュームを起動します。簡単にマイクロを使用してピペットミックスとスピン。
   3. 70℃で5分間インキュベート° C mRNAのいずれかの二次構造を変性させる。すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。
   4. （再びマスターミックスを使用して）追加します。
      • 0.3μLRNasin（40 U /μL）
      • 0.45μLスーパースクリプトIII（200 U /μL）
      • 1μLのヌクレアーゼフリー水
   5. ピペットで混合し、スピン簡潔に。 42℃で1時間インキュベート℃を
   6. ℃で15分間、上付き文字を不活性化するために70でインキュベートする。次の手順に進みます。
2. ラウンド1第二鎖cDNA合成
   合成Oを支援するために、mRNAの/ DNAハイブリッドのmRNAの部分からのRNAのプライマーを作成するfは二重鎖cDNA。
   1. • ICE ON
      • 12μlの第一鎖の反応に、追加します。
      • 8μLのヌクレアーゼフリー水
      • 7.5μlの5倍第二鎖バッファー
      • 0.75μLdNTPミックス（2.5 mMの各）
      • 0.25μLDNAリガーゼ（10 U /μL）
      • 1μLのDNAポリメラーゼI（10 U /μL）
      • 0.25μLRNase H活性（2 U /μL）
      ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16歳で2時間インキュベート℃に
   2. 追加：1μLT4 DNAポリメラーゼ（5 U /μL）。ピペッティングし、スピン短時間でミックス。 16℃でさらに10分インキュベートする。
   3. ¹¹ウォッシュ2回500μLの洗浄緩衝液の代わりに750μLで1時間：わずかな修正では、メーカーの指示に従ってキアゲンアプライキットを使用して反応をクリーンアップします。ヌクレアーゼフリー水で溶出します。
   4. Speed​​vacまたはエタノール沈殿によってを使用して2から4μLに集中する。エタノール沈殿の場合は、グリコーゲンが核酸キャリアとして機能し、DNAまたはRNAの少量を沈殿させるときに使用されます。酢酸ナトリウムからナトリウムは析出を助ける、DNA骨格の負電荷を中和するのに役立ちます。それは、ルーチンの沈殿のためのマスターミックスを作成する必要はありません。
      • 29μLのDEPC水を加える
      • 2μLグリコーゲン（5mg/mL）
      • 1 / 10量（3μL）の3M酢酸ナトリウム
      • 2.5倍量（〜250μL）冷100％エタノール
      よく混ぜる。 -80℃で沈殿° C（30分。O / Nへ）。
   5. 4℃で20分間遠℃に
   6. 上清を除去し、800μL、70％エタノールでペレットを洗浄。完全にピペッティングあるいは過剰な塩分の除去を支援するために、ボルテックスのいずれかによってペレットが剥がれないようにしてください。
   7. 4℃でさらに20分間遠心℃を15〜20分間乾燥した上清と空気を取り外します。
   8. ヌクレアーゼフリー水を4μLに懸濁します。 -20または-80℃で保存するか、次の手順に進みます。
3. in vitro転写ラウンド1（IVT）：
   二本鎖cDNAに組み込まT7プロモーターからのアンチセンスRNAを合成する。
   1. この反応は、代わりに20μLの反応を10μLのためにスケーリングを除いては、メーカーの指示に従ってアンビオンMEGAscript T7キットを使用して実行されます^。12これは、室温でこの反応を組み立てることや、組み立ての際に、室温でバッファーを維持することが不可欠です。それは氷冷の場合、指定されたバッファは、DNAを沈殿する。使用しないときは、氷の上で次のNTPと酵素ミックスをしてください。
      • 常温、
      • 薄壁PCRチューブに再懸濁した二本鎖cDNAを転送します。
      • 4μLNTPミックスを追加（18.75 mMの各）
      • 1μL10 ×反応緩衝液
      • 1μL10xの酵素ミックス
   2. 37℃で14時間のインキュベートしますサーモでC（望ましい）またはインキュベーター。
   3. この反応は、Speed​​vacまたはエタノール沈殿を用いてサンプルの濃度に続く二つの異なる方法を使用してクリーンアップすることができます。キットを使用してクリーンアップするため、標準的なフェノール/クロロホルム抽出とクリーンアップの方法Aに進みます、方法Bに進みます
   4. 方法：
      1. 500μLの洗浄緩衝液の代わりに750μlの1時間で2回洗浄する：いくつかの修正¹³で、製造元の指示に従って、Ambion社Megaclearキットを使用して反応をクリーンアップします。溶出のステップでは、列の中央にヌクレアーゼフリー水50μLを追加し、70℃で10分間インキュベートCを。 1分間10,000 gでスピン。新しいチューブに繰り返します。溶出液を組み合わせる。 Speed​​vacまたはエタノール沈殿によってを使用して2から4μLにサンプルを集中する。
      2. エタノール沈殿のための：それは核酸と遊離ヌクレオチドの共沈を防ぐことで効率的なので酢酸アンモニウムは、このケースでは酢酸ナトリウムの代わりに使用されます。これは、NTPの下流の反応を阻害することができるのIVT反応で使用される高濃度のために重要です。
         • 50μLDEPC水を加える
         • 2μLグリコーゲン（20 mg / mLの）
         • 0.6ボリューム（37.2μL）の5M酢酸アンモニウム
         • 2.5倍量（〜180μL）の冷エタノール
      3. -80℃で沈殿° C（30分。O / Nまで）*
      4. 4℃で20分間遠℃に
      5. 上清を除去し、（ヌクレアーゼフリーの水で）800μLを70％エタノールでペレットを洗浄。完全に過剰な塩分のすべてを削除するには、ペレットが剥がれないようにしてください。
      6. 4℃でさらに20分間遠心℃を
      7. 上清と空気乾​​燥15〜20分を削除します。
      8. 4μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁します。
   5. 方法B：
      1. また、aRNAを標準のフェノール/クロロホルム抽出を使用してクリーンアップすることができます。
         • 50μLDEPC水を加える
         • 2μLグリコーゲン（20 mg / mLの）
         • 0.6ボリューム（37.2μL）5M酢酸アンモニウム
         • 1ボリューム（98μL）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール25:24:1（pHが7.8から8.0に平衡化）
      2. 15秒間ボルテックス。テーブルトップの遠心で半最大速度で1.5分間、遠心します。冷エタノールの2.5倍量（245μL）を含む新しいチューブに上部の水層を移す。
      3. -80℃で沈殿° C（30分。O / Nへ）。
      4. 4℃で20分間遠℃に
      5. 800μLを70％エタノール（ヌクレアーゼフリーの水で）と上清と洗浄ペレットを削除します。完全に過剰な塩分のすべてを削除するには、ペレットが剥がれないようにしてください。
      6. 4℃でさらに20分間遠心℃を
      7. 上清と空気乾​​燥15〜20分を削除します。
      8. 4μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁します。
         
         *サンプルは、一晩インキュベーション中にこの温度で​​フリーズする場合があります。それは、これは実際には核酸の収量を増加させることができることが示されている。
4. 第2ラウンド第一鎖cDNA合成
   1. • ICE ON
      • 1μLランダムプライマー（0.05 mg / mL）に*を追加
   2. 70熱℃で10分間。すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。
   3. • 2μL5倍ファーストストランドバッファーを追加します。
      • 1μLDTT（100mMの）
      • 0.5μLdNTPの（2.5mMの各）
      • 0.5μLRNasin（40 U /μL）
      • 1μLスーパースクリプトIII（200 U /μL）
   4. ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。室温で10分間座ってすることができます。このステップは、逆転写反応が行われる前に、短いランダムプライマーの延長を可能にするために必要です。
   5. 42℃30分間インキュベート℃に
   6. 95℃でヒート5分° C DNA / RNAハイブリッドのRNAを変性させる。少なくとも5分間氷上に置きます。 -20℃で保存または-80 ° Cまたは直後に次の手順に進みます。
      
      ランダムプライマーの*濃度は重要です。濃度が高すぎる場合、製品はより多くの増幅の各ラウンドで切り捨てられます。
5. 第2ラウンド第二鎖cDNA合成
   1. • ICE ON
      • 2μLT7 -オリゴ（dT）プライマー（μL/ 10 NG）*を追加
   2. 70℃で5分間熱すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。簡単にスピン。
   3. • 43.5μLのヌクレアーゼフリーの水を追加します。
      • 15μL5倍第二鎖バッファー
      • 1.5μLdNTPミックス（2.5 mMの各）
      • 2μLDNAポリメラーゼI（10 U /μL）
   4. ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16歳で2時間インキュベート℃に
   5. 2μLT4 DNAポリメラーゼ（5 U /μL）を追加する
   6. ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16℃でさらに10分インキュベートする。
   7. セクション6.2.3のようにキアゲンアプライキットを使用して反応をクリーンアップします。
   8. セクション6.2.8に6.2.4のようにSpeed​​vacまたはエタノール沈殿を2から4μLに集中する。
      
      *第一ラウンド第二鎖cDNA合成に比べてT7 -オリゴ（dT）プライマーの異なる株式の濃度を注意してください。
6. in vitro転写で第2ラウンド
   第6.3節のように実行します。
   1. セクションを何度も6.4から6.6希望の番号を繰り返します。なお、短いaRNAの製品の増幅の結果のそれぞれの後続のラウンド。増幅のラウンド数は、この理由のために制限する必要があります。通常は、増幅の2〜3ラウンドでは、マイクロアレイ解析を実行する単一の細胞から採取した材料を増幅するのに十分です。マイクロアレイ解析の場合には、第三ラウンドのIVT反応は、メーカーの指示に従ってイルミナTotalPrep RNA増幅キットを使用して実行されます。この手順では、マイクロアレイチップ上の検出に使用されるaRNAのにビオチン標識UTPを内蔵しています。
   2. ナノRNAキットに光度計またはアジレントバイオアナライザを使用して第三ラウンドaRNAの濃度を測定する。

7。代表的な結果

初代神経培養物からの単セルの成功の収穫は（図1を参照）適性に応じて、2分未満で完了することができます。しかし、収穫のための時間は、システム間で、実験操作が介在すると変化します。 （図4Aおよび4Bを参照）の合計増幅されたaRNAのマイクログラムの量で結果aRNAの手順に単一のセルを供するとバイオアナライザ（図3を参照）で分析するときに特徴的なブロードなピークを生成します。三回は、単一細胞の遺伝子発現の迅速な分析が可能、三日の最低で完了することができます。

図1。示されているのは単離ニューロンの豊作の一例です。我々は、セレ比較的低密度の領域を（）CTEDと、目的のセル（B）に向かってピペットチップを進めた。細胞が収穫された後にサード画像（C）は、ビューのフィールドを示しています。周囲のプロセスは、カバースリップ上に残っていることに注意してください。

図2。示されているのは効果的な収穫のための不適当な大きさのピペットチップの2つの画像です。これらのヒントは、不完全な収穫（A）と（B）はそれぞれ環境を周囲の収穫につながる。

図3バイオアナライザを使用して、次の収穫と増幅、解析が増幅されたRNAの分布や量を調べることをお勧めします。単一細胞の材料から成功した増幅、低マイクログラムで合計金額が得られますし、スムーズと広い分布を持つことになります。

図4。最初のラウンド（）の回路図とaRNAの手続きの第二ラウンド（B）が表示されます。

Discussion

注意事項とトラブルシューティング

• あなたは前と後に標的細胞が単離されたことを示す画像と、残りの半影はそのまま残されたものになるとよいでしょう。
• あなたが収穫されるためあまり解決策は、ピペットを入力している場合は、3ウェイルアーロックフィッティングとチューブに正圧を保持するシリンジ用プランジャーを使用することができます。任意のボリュームは、処理の種類によって異なりますが、最大5μlのは、ほとんどのアプリケーションで問題ないはずです。

分子生物学的手法の一般的なヒント

• 渦すべての株式のチューブを、反応に添加する前に、それらをスピンダウン。 NEVER渦酵素。
• 徹底的にバッファが適切な濃度であることを保証するために酵素を加える前に反応を混ぜる。
• 可能であればstratacoolerを使用して-20℃で酵素の在庫を保管してください。そうでない場合は、、右使用前に取り外して氷上に保持し、-20℃にすぐに戻ります
• 常にピペッティングエラーを減らすために複数の反応を準備する時、マスターミックスのこと。サンプル数に基づいて必要な量を計算すると10-20％を追加。
• 店舗RNA -80 ° Cを遅らせる劣化へ。 RNAは酸性条件下で発生するRNAのa​​purinationを遅らせるためにバッファに格納されている最も安定しています。

aRNAの手順の一般的な概要

図4Aは、aRNAの手順の最初のラウンドを示しています。第一鎖の反応では、T7 - oligo（dT）プライマーのポリ- T部分は、ポリA尾部に結合することによってmRNA種（長い白い長方形）のために選択されます。いくつかのマイクロRNAは、ポリアデニル化されると、このプロシージャによって取得されます。さらに重要なことは、しかし、細胞の中で最も豊富なRNAは、リボソームRNAは、しません。このオリゴは、テンプレートとしてmRNAを用いたcDNA（長い灰色の長方形）の相補鎖を合成する逆転写酵素のためのプライマーとして機能します。 T7 -オリゴ（dT）プライマーのT7の部分は、開始mRNAに配列をアンチセンスでフレーム内のT7 RNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれています。これは、in vitroでの転写反応の後半で使用されています。

次に、前の手順で作成した発現/ DNAハイブリッド中のmRNAは、ラギング鎖のDNA合成で作成された岡崎フラグメントと同様のRNA"プライマー"を（小さな白い長方形）を作成RNアーゼHによって部分的に加水分解される。 DNAポリメラーゼは、私がテンプレートとしてmRNAに相補的なDNAを使用してプライムDNA合成にRNA断片を使用しています。それは次のRNA断片に到達すると、その5'から3'ヌクレアーゼ活性は、リボヌクレオチドを​​除去し、デオキシリボヌクレオチドに置き換えます。 DNAリガーゼは、リーディング鎖の交換が​​完了していない任意の鎖を連結するために追加されます。 RNA断片は、DNAポリメラーゼIが作成するための最初のプライマーとして役立ったところ、T4 DNAポリメラーゼは、エリアを埋めるために追加されて平滑末端に二重次にIVT反応を実行する前に精製される二本鎖cDNAを。

IVT反応では、T7 RNAポリメラーゼは、鋳型としてセンス鎖を使って二重鎖cDNAと合成するアンチセンスRNA分子（長い黒い長方形）に組み込まれたT7プロモータに結合する。これは、アンチセンスRNA分子の数千が各二本鎖cDNA分子（図4A）から生成される増幅のステップとして機能します。

図4Bに示すように第二ラウンドは、、出発RNAはアンチセンス（黒く塗りつぶした矩形）であるとT7 -オリゴの標的にされたポリアデニル化した尾部を欠いているので、最初のラウンドのそれとは若干異なる逆転写反応から始まり、最初のラウンドで（dT）プライマー。したがって、この反応は、ランダムプライマー（小さなグレーの長方形）と続いて変性RNAを発揮する。第二鎖の反応は、前述の逆転写反応で作成したセンスRNAの3'末端にポリA配列に結合するT7 -オリゴ（dT）プライマーでプライミングされています。別のIVT反応は、最初のラウンドと同様に実行されます。この第二ラウンドは、通常、単一の細胞から増幅3回を達成するには、少なくとも一回繰り返されます。

アプリケーション

我々はこの記事で紹介されていることの技術は多数のアプリケーションに変換することができます。単一細胞の単離のプロトコールは、急性スライスで使用するために変更することができます^。14技術的に困難なものの、同じ原則が、この代替の準備に適用されます。ピペットのサイズが若干調整されている場合はさらに、細胞の生理機能の録音は、収穫が生理的な出力の背後にある分子メカニズムの十分に制御された調査を許可する前に行うことができます。別の若干の修正は^15が 、このアプリケーションでは。細胞体からプロセスを分離することになってピペットで細胞体を収集し、新鮮なピペットで戻って、100から300に識別dendritを収集するESまたはコレクションチューブあたり軸索^。。16

一度細胞が収穫されて、mRNAの存在量と組成の比較は、同一の細胞集団内でも異なるとの間で行うことができます。第三ラウンドにビオチン- UTPを組み込んだaRNAのは、これらの相対的なmRNAの存在量を決定するためにマイクロアレイ解析が可能になります。オリジナルのmRNAの人口の組成物はまた、次世代シーケンシングを使用してaRNAの手順の後に決定することができます。増幅されたaRNAを、前者のように後者の細胞型の表現型の変化を誘導するために、ひとつの細胞型からのmRNAの完全なセットが異なる細胞型にトランスフェクトされた細胞の表現型の変換の研究を確認するためにも使用できます。手順ラボが開発し、TIPeRとして知られている^。17これらの研究は、病気の状態や細胞の表現型とそのような研究を研究するために特に有用であるが、ラボで現在進行中です。 RT - PCRや定量PCRは、細胞特異的遺伝子の発現を確認するために増幅された材料で行うことができます。さらに、トランスフェクションまたは形質導入の効率性の評価は、単一細胞レベルで行うことができます。

利点と制限事項

抽象的に記載されているように、分析のための単一細胞の単離は、異種細胞集団の解析で見られる平均化の効果がなくなります。これらの平均化の効果は、豊富な転写を過剰表現して平均化し、多くの発現量の低い転写産物の検出を防止することにより、単一細胞内のmRNAの存在量を偽る。フローサイトメトリーは、個々のセルを並べ替えるために使用されますが、この方法は、細胞特異的マーカーと高価な機器の知識が必要です^。18レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはどちらUVやIRレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムと単一のセル、さらには細胞内取り込みを可能にするだけの目的の細胞を必要とすることができます非常に薄い切片の表面に位置する^。19はフローサイトメトリーと同様に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはまた、高価な機器が必要です。

上記の電極ベースのコレクションの技術の主な利点の1つは、その貴重な電気生理学的データが同じセルで実行される機能性とトランスクリプトーム解析を可能にする、収穫の前に目的の細胞から得ることができるからである。私たちの技術の²⁰の欠点があるそれは、マニピュレーターを使用して経験を必要としないこと。マイクロマニピュレータに精通して研究者らは、このテクニックは非常に直感的にわかりますが、そのような経験を持つ個人が必要な細かい動きに慣れる必要があります。

任意の増幅技術に内在するには、サイズと塩基組成に基づいて特定の転写産物の選択的増幅です^。4,6,7ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）、cDNAの迅速増幅のようなベースのテクニックは線形増幅のaRNAの増幅法の結果、一方の端（RACE）の転写産物の指数関数的増幅の結果、。このように、aRNAの手順の主要な利点の一つは、より指数関数的に増幅するのではなく、唯一の直線的に増幅過程で発生したエラーやバイアスを増幅することによってmRNAの転写産物の相対的存在量を維持する能力にあるエラーやバイアスは言った。

マイクロアレイ解析と相まってaRNAの手順は、処理または未処理同様のまたは別の形態の単セル間のmRNAの存在量の比較ができます。さらに、増幅された材料は、次世代シーケンシングのために提出することができます^。5,8がしかし、、手続きのためのランダムプライマーを使用することとは対照的に、オリゴ- dTプライミング手順はの偏見の増幅上記以来、このような分析には注意が必要mRNAおよび各ラウンドで、その後の増幅された物質のわずかな短縮で、一般的に、結果の3'末端。ケアは、いくつかの偽の不在コールが若干短縮増幅された物質から発生することができるように標準的な方法とマイクロアレイの結果を分析することに注意してください。さらに、シーケンシングの結果は確かに全5提供する間、"オリジナルのmRNAのほとんどのシーケンスを、5'いくつかのmRNAのシーケンスが見逃される可能性があります。これらの理由により、増幅のラウンド数を制限する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511