단일 셀 Transcriptome 분석

Summary

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

Abstract

대부분의 유전자 발현 분석 기술 문화 조직 homogenates이나 세포에서 세포의 이질적인 인구의 격리 물질에 의존하고 있습니다. ^1,2,3 두뇌의 경우, 같은 해마로 영역 각각 다른 세포 유형의 복잡한 배열을 포함 서로 다른 mRNA 프로필. 단일 세포를 수확하는 능력은 세포 인구 사이 내의 분자의 차이점에 대한 심층 조사에 더 있습니다. 우리는 더 이상 처리를위한 세포를 수확하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 자주 전기 생리학에서 사용 Pipettes는 (열망 사용) 관심의 세포를 분리하기 위해 활용하고 편리하게 분자 생물학 기술의 번호와 추가 처리를 위해 Eppendorf 튜브에 그것을 입금하고 있습니다. 우리 프로토콜 세포 배양이나 급성 조각에서 개별 세포에서 dendrites의 수확 수정할 수 있습니다.

우리는 또한 단일 셀 isolations의 주요 다운 스트림 응용 프로그램으로 아르나의 증폭 방법을 설명합니다. 이 방법은 같은 리버스 녹음하거나 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 등의 유전자 발현 분석 기술의 대안으로 우리 연구실에 의해 이전에 개발되었습니다. ^4,5,6,7,8이 기술의 선형 증폭을 위해 제공 polyadenylated RNA는 재료만을 femtograms로 시작하는 안티 센스 RNA 및 마이크로 그램의 금액에 결과. 선형 증폭 재료는 절연 세포의 transcriptome의 구성 요소의 상대적인 풍요의 PCR 증폭 지수보다 정확한 견적을 제공합니다. 기본 절차는 증폭의 두 라운드로 구성되어 있습니다. 간단히, T7 RNA 효소 프로 모터 사이트는 mRNA의 기록에서 만든 두 번 좌초 cDNA에 통합됩니다. 시험 관내 전사의 하루 (IVT) 반응은 다음 T7 RNA 효소는 이중 좌초 cDNA로부터 많은 안티 센스 성적표를 생산하는 수행됩니다. 두 번째 라운드는이 과정을 반복하지만 시작부터 자료 몇 가지 기술적인 차이와 안티 센스 RNA입니다. 그것은 증폭의 3 라운드의 결과로, 두 번째 라운드를 반복하는 기준입니다. 종종, 시험 관내 전사 반응에서 세 번째 라운드는 생산 안티 센스 RNA가 hybridized와 microarray를 감지 수 있도록 biotinylated 뉴클레오 사이드의 triphosphates를 사용하여 수행됩니다. ^7,8

Protocol

1. 세포 배양

우리 연구실은 아래의 실험에 대한 기본의 연결을 쥐 hippocampal 문화를 사용합니다. 다음은 이러한 세포 문화가 생성, 유지하는 방법에 대한 수정된 뱅커 프로토콜을 설명합니다. ^9, 물론, 이러한 세포 culturing 기법 permutations 및 설립 방법의 철저한 번호를 제공하는 특정 실험실의 특정 요구에 있는데 맞게 조정됩니다 세포의 지속 건강한 공급 적합한 대체됩니다.

1. 다섯 autoclaved, 라운드, 12mm의 coverslips는 35mm 요리에 배치하고, 물 (세포 배양 등급)을 씻어서, 80 μg / ML borate 버퍼 O / N에서 폴리 - D - 라이신 (MW 70-150,000)에 입혀져 있습니다 borate 버퍼 O / N 1 μg / ML의 Laminin과 코팅 그런 다음 물로 씻어서 다시. NG 미디어 (포도당 (0.6 % W / V)와 보충 얼의 소금과 GlutaMAX, 페니실린 (100 U / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ML), 말 혈청 (10 % V / V)로 멤) 추가 및 요리입니다 인큐베이터 (5 % CO ₂ 37 ° C)에 저장됩니다. PDL150/laminin는 monolayer로 성장하기 위해 고립된 뉴런에 기판 역할을합니다. coverslips는 도금 전에 최대 2 주가 코팅 수 있습니다.
2. 도금의 날, 배아 일 18 쥐 hippocampi에서 기본 뉴런은 100,000 셀 / ML 정지의 1.5 ML를 추가하여 NG 미디어 도금입니다. 도금 후 4 ~ 6 시​​간은 각 35mm 요리는 사이 토신 베타 - D - arabinofuranoside (ARA - C)은 어떤 오염 glial 세포의 성장을 방지하기 위해 5 mm의 0.75 μL로 처리됩니다. 스물 네 시간 후에, 도금 미디어는 얼의 소금과 W / V 포도당 0.6 %, 1 ㎜의 나트륨 pyruvate 및 B27와 함께 보충 L - 글루타민과 함께 멤으로 변경됩니다. 전지는 프로세스의 완전한 발전을 허용하는 모든 실험에 사용하기 전에 적어도 두 주 동안 성장을 사용할 수 있습니다.

2. 준비 Pipettes

RNases에 대한 참고 사항 : 피부, 타액, 심지어 호흡이 RNases의 주요 소스, RNA을 저하 효소입니다. 그것은 RNase가없는 기술은 시료가 RNases으로 오염되고 이후 저하하지 않도록 프로토콜에서이 시점에서 관찰하는 것이 필수적입니다. 이것은 항상 샘플 및 시약을 처리하는 샘플 또는 시약을 통해 이야기 결코, 장갑을 착용하고, 소독 피펫 팁 및 튜브의 새로운 상자를 사용하여 포함합니다. 종종, RNA 작업에 독점적으로 지정되지 않은 pipettes 그러한 RNase 있든 (분자 Bioproducts)로 RNase 처리 솔루션을 닦고하여 소독하고 있습니다. 그것이 치료를 통해 샘플의 오염을 방지하는 것도 중요하므로 그러나 이러한 솔루션은 하류 효소 반응을 억제합니다.

1. 압력솥 1.5 mm 외경 (OD) 유리 pipettes.
2. micropipette의 풀러를 사용하여 풀러, 필라멘트, 그리고 pipettes에 따라 달라질 수 있습니다 electrophysiological 레코딩에 적합한 직경에 pipettes를 가져옵니다. ¹⁰ 구멍 크기가 팁이 세포 수집하기 전에 고장난 것입니다 때문에 너무 중요하지 않습니다.
3. 조심스럽게 도움말을 (이상 micropipette 저장 병을 사용하여) 그대로 유지하는 먼지없는 환경에서 pipettes를 저장합니다.
4. 제어 방식으로 팁을 깨고 한 손에 손가락 사이에 긴장 늦추지 kimwipe를 개최하고 매우 부드럽게 용지 1-2 회 걸쳐 피펫의 팁을 브러시. 개방 대상 셀 크기의 약 75-100%되어야합니다. 원하는 결과를 얻을 때까지이 단계를 조정합니다.

3. 준비 문화, 튜브, 그리고 현미경

1. 1.7 ML Eppendorf 튜브에 원하는 숫자를 준비합니다. 자료 단세포 amplifications, 또는 수확 자료의 저장을위한 다른 솔루션을 사용할 수있다면 PBS 먼저 스트랜드 버퍼 2 μL를 추가합니다.
2. 수확 들어, micromanipulator가 장착되어 40x 목적으로 가벼운 현미경이 필요합니다. 유연한 관 멀리 홀더에서 선두와 피펫 홀더를 사용하십시오. 수집하는 동안 피펫의 불필요한 움직임을 방지하기 위해 안정적인 표면에 부착 튜빙을. 튜브의 끝에, Luer - 잠금 연결 1 ML의 주사기가 사용자 사이에 부착하고 변경할 수 있도록 바늘을 삽입합니다.
3. coverslips를 사용하는 경우 한 번에 하나의 coverslip와 함께 작동합니다. 필요한 경우, * 선택 PBS 또는 미디어를 포함하는 새로운 35mm 요리에 하나 coverslip을 전송. 더 이상 세포 배양기 밖 있으며, 더 건강하지 못한 그들은 될 것입니다 그들의 mRNA 프로필이 더 건강한 세포의 이탈합니다. 그것은 그들과 함께 작동하지 않는 경우 배양기에서 그들을 유지하여 다른 coverslips에있는 세포의 건강을 유지하기 위해 중요합니다. 보육 이외의 세포로 최대한 빨리 작동합니다.

실제 요리의 벽이 coversli 향해 micropipette의 적절한 발전을 허용하는 너무 높게되므로 * 우리의 설치와 함께 그것은 35mm 요리의 뚜껑을 사용해야합니다P.

4. 수확 셀

1. micropipette 홀더에 micropipette를 확보. micromanipulators에 삽입하는 접사 micropipette 홀더. 40x 목표를 설정합니다.
2. 현미경 단계에있는 접시를 놓고 수확에 적합한 세포의 영역을 찾습니다. 기본의 연결을 문화의 경우, 세포가 주변 세포 및 / 또는 프로세스의 수확을 방지하기 위해 이웃에서 상대적으로 격리해야합니다. 소마와 프로세스 사이의 mRNA의 성적의 인구는 체세포 mRNAs에 관심이 생긴다면 전적으로, 프로세스와 소마의 오염을 방지하기 위해주의 이동해야 다릅니다. 이보기의 필드의 중앙에 수확하고자하는 세포를 놓습니다.
3. 빛의 경로에 접시에 용액쪽으로 micropipette 발전을 micromanipulator를 사용합니다. 솔루션에 피펫 팁을 낮추십시오. 주사기를 통해 가볍게 불어로이 시점에서 긍정적인 압력을 적용합니다. 접안 렌즈를 통해보세요. 피펫 볼 분야의 그림자로 나타납니다. 그것은 거친 초점 손잡이를 사용하여 피펫 팁을보고 초점 분야 이내 때까지 세포의 비행기 위에서, 피펫 팁의 위치를​​ 조정합니다. 피펫의 구멍 크기가 너무 크거나 너무 작은 경우에는이 시점에서, 그것은 평가해야합니다. 연습 수확은 올바른 구멍 크기가이 시점에서 실현되었는지 확인하는 기능을 제공합니다.
4. 자, 세포의 비행기쪽으로 피펫을 사전. 끝 그것은 당신이 수집하고자하는 영역에 침입하는 원인도 황급히 고급 없다는 것이 중요합니다. 이것을 방지하기 위해, micromanipulators를 사용하여 세포를 향해 피펫 팁을 발전하기 전에 초점 비행기의 발전을 거친 초점을 사용합니다. 세포 및 피펫 팁 모두 초점 때까지이 세포 가까이되면 벌금 초점을 사용합니다. 당신이 coverslip 그들을 날려 방지하기 위해 세포의 비행기에 도달하기 전에 긍정적인 압력을 적용 중지합니다.
5. 당신이 수확하고자하는 셀 소마에 닿으 있도록 피펫의 팁을 위치로 micromanipulators을 사용합니다.
6. 세포는 피펫 팁을 입력 때까지 주사기를 사용하여 입으로 부드럽게 흡입을 적용합니다. 세포가 피펫를 입력하지 않으면 그것은 coverslip에서 리프트까지 부드럽게 가깝게 셀을 클릭하고 아래로 제보를 이동합니다.

5. 셀을 저장

1. 즉시 솔루션의 피펫을 밖으로 이동 micromanipulator를 사용합니다.
2. 홀더에서 피펫을 제거합니다.
3. 한손에 1.7 ML Eppendorf 튜브를 잡고 부드럽게 아래 방향으로 튜브의 측면에있는 피펫의 팁을 휴식. (0.1 ML 마르크를 위해 조준.)
4. 튜브 안쪽 중심으로 부러진 칼끝으로 피펫의 맨 오프닝에 1-3 ML의 주사기에 부착된 바늘을 삽입합니다. 신속 튜브 밖으로 스프레이로 피펫의 솔루션을 강제 플런저를 우울. 세포는 피펫의 매우 끝에 남아 있어야이 제대로 세포를 추방하기 위해 적절한해야합니다. 모세관 작업은 피펫으로 액체를 다시 나타납니다로 튜브의 측면에 대한 액체로 팁을 접촉하지 않도록주의하십시오.
5. 신속하게 데스크탑 microfuge를 사용하여 튜브의 내용을 스핀 다운 및 즉시 냉동 (-80 ° C에 저장) 또는 추가 처리 (바람직)에 얼음에 놓으십시오.

6. 아르나의 증폭

1. 한 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 라운드 :
   mRNA / cDNA 하이브리드를 만듭니다.
   1. 단세포 수집 볼륨의 모든 5 μL 들어, 컬렉션 튜브 (얼음)에 다음 1X를 추가합니다. 반응은 (10 μL 수집 볼륨 등 배)보다 큰 컬렉션 볼륨에 확장할 수 있습니다. 오류를 pipetting을 위해 계정에 컬렉션 튜브의 수를 더한 10-20%하여 다음과 같은 시약을 곱하여 마스터 믹스를 만듭니다. 아르나의 ampification 절차의 모든 후속 반응에 대해이 작업을 수행합니다.
      • 얼음
      • 1.2 μL dNTP의 (2.5 MM 각)
      • 2.4 μL 배 퍼스트 스트랜드 버퍼
      • 0.3 μL T7 -​​ oligo (DT) 프라이머 (100 μL / NG)
      • 1.2 μL DTT (100 ㎜)
   2. nuclease 무료 물로 10.25 μL에 볼륨을 가져와. 피펫 믹스와 스핀 간단히 microfuge를 사용합니다.
   3. 70 5 분 품어 ° C mRNA의 차 구조를 변성 수 있습니다. 즉시 적어도 5 분 동안 얼음에 놓으십시오.
   4. (다시 마스터 믹스를 사용) 추가 :
      • 0.3 μL RNasin (40 U / μL)
      • 0.45 μL 윗첨자 III (200 U / μL)
      • 1 μL nuclease 무료 물을
   5. 피펫 믹스와 스핀 짧게. 42에서 1 시간 동안 품어 ° C.
   6. ° C 15 분 윗첨자를 inactivate 70에서 알을 품다. 다음 단계로 진행하십시오.
2. 1 라운드 두 번째 가닥 cDNA 합성
   합성 O에 투입 mRNA / DNA 복합체의 mRNA 부분에서 RNA의 primers 만들기F 더블 cDNA 좌초.
   1. • 얼음
      • 12 μL 첫번째 스트랜드 반응 추가 :
      • 8 μL nuclease 무료로 물
      • 7.5 μL 배 둘째 스트랜드 버퍼
      • 0.75 μL dNTP 혼합물 (2.5 MM 각)
      • 0.25 μL DNA ligase (10 U / μL)
      • 1 μL의 DNA 중합 효소 I (10 U / μL)
      • 0.25 μL Rnase H (2 U / μL)
      pipetting에 의해 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 16에서 2 시간 동안 품어 ° C.
   2. 추가 : 1 μL T4의 DNA 중합 효소를 (5 U / μL). pipetting과 스핀 짧게하여 섞는다. 16 ° C. 10 분만 더 품어
   3. ¹¹ 와시 2 배 500 μL 세척 버퍼 대신 750 μL 1 시간 : 약간의 수정으로 제조 업체의 지침에 따라 같은 Qiagen MinElute 키트를 사용하여 반응을 정리. nuclease 무료로 물에 Elute.
   4. Speed​​vac이나 에탄올 침전에 의해를 사용하여 2-4 μL에 집중. 에탄올 침전 경우, 글리코겐은 핵산 캐리어의 역할과 DNA 또는 RNA의 소량을 precipitating 때 사용됩니다. 아세트산 나트륨에서 나트륨이 석출에 은닉, DNA 백본의 부정적인 요금을 중화하는 데 도움이됩니다. 그것은 일상 precipitations에 대한 마스터 믹스를 만들 필요는 없습니다.
      • 29 μL DEPC 물을 추가
      • 2 μL 글리코겐 (5mg/mL)
      • 10분의 1 볼륨 (3 μL) 3M의 아세트산 나트륨
      • 2.5 볼륨 (~ 250 μL) 차가운 100 % 에탄올
      잘 섞는다. -80에서 침전물 ° C (30 분. O / N)를.
   5. 4 20 분 동안 원심 분리기 ° C.
   6. 뜨는를 제거하고 800 μL 70 %의 에탄올과 펠릿 씻으십시오. 완전히 pipetting 또는 과도한 소금의 제거에 도움을 vortexing을 통해 펠렛을 이동시키다해야합니다.
   7. 4 또 다른 20 분 동안 원심 분리기 ° C. 15~20분에 대한 건조 뜨는 및 공기를 제거합니다.
   8. nuclease 무료 물을 4 μL에 Resuspend. -20 또는 -80에서 저장소 ° C 또는 다음 단계로 진행합니다.
3. 시험 관내 전사에서 1 라운드 (IVT) :
   이중 좌초 cDNA에 반영된 T7 프로 모터의 안티 센스 RNA를 합성.
   1. 이 반응은 대신 20 μL 반응 10 μL에 대한 축소를 제외하고 제조 업체의 지침에 따라 같은 앰비온 MEGAscript T7 키트를 사용하여 수행됩니다. ¹² 그것은 실내 온도에서이 반응을 조립하고 조립하는 동안 실온에서 버퍼를 유지하기 위해 필수적입니다. 그것이 얼음처럼 차가워요 경우 제공된 버퍼 DNA을 촉진합니다. 얼음 사용하지 않을 때에서 NTPs 및 효소 혼합 보관하십시오.
      • 상온에서
      • 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 resuspended 더블 좌초 cDNA를 전송합니다.
      • 4 μL NTP 믹스 (18.75 MM 각) 추가
      • 1 μL 10X 반응 완충액
      • 1 μL 10X 효소 믹스
   2. 37 14 시간을 품어 ° thermocycler에서 C (바람직) 또는 보육.
   3. 이 반응은 Speed​​vac 또는 에탄올 석출를 사용하여 샘​​플의 농도를 다음 두 가지 방법을 사용하여 청소하실 수 있습니다. 키트를 사용하여 정리, 표준 페놀 / 클로로포름 추출과 정리에 대한 방법 A. 진행 방법 B. 진행
   4. 방법 A :
      1. 워시 2 배 500 μL 세척 버퍼 대신 750 μL 1 시간 : 일부 수정 ¹³ 제조 업체의 지침에 따라 같은 앰비온 Megaclear 키트를 사용하여 반응을 정리. 용출 단계에 대해 ° C 10 분 70 품어 칼럼의 중심에 nuclease 무료로 물 50 μL를 추가합니다. 1 분 1만g에 스핀. 새로운 튜브에 반복합니다. eluates을 결합합니다. Speed​​vac 또는 에탄올 침전에 의해를 사용하여 2-4 μL 샘플을 집중.
      2. 에탄올 침전을 위해 : 그것은 핵산과 함께 무료로 세포핵의 공동 침전을 방지에 효과적이기 때문에 질산 아세트산이 경우 아세트산 나트륨 대신에 사용됩니다. 이는 NTP가 하류 반응을 억제 수 IVT 반응에 사용되는 높은 농도의 것이 중요합니다.
         • 50 μL DEPC 물을 추가
         • 2 μL 글리코겐 (20 MG / ML)
         • 0.6 볼륨 (37.2 μL) 5M 질산 에틸
         • 2.5 볼륨 (~ 180 μL) 차가운 에탄올
      3. -80에서 침전물 ° C (30 분. O / N)를 .*
      4. 4 20 분 동안 원심 분리기 ° C.
      5. 뜨는를 제거하고 800 μL 70 % 에탄올 (nuclease 무료로 물)와 펠렛을 씻으십시오. 완전히 초과 소금을 모두 제거하는 펠렛을 이동시키다해야합니다.
      6. 4 또 다른 20 분 동안 원심 분리기 ° C.
      7. 뜨는 공기 건조 15-20분를 제거합니다.
      8. 4 μL nuclease 무료로 물에 Resuspend 펠릿.
   5. 방법 B :
      1. 또는, 아르나는 표준 페놀 / 클로로포름 추출과 청소하실 수 있습니다.
         • 50 μL DEPC 물을 추가
         • 2 μL 글리코겐 (20 MG / ML)
         • 0.6 볼륨 (37.2 μL)5M 질산 에틸
         • 1 볼륨 (98 μL) 페놀 : 클로로포름 : isoamyl 알콜 25:24:1 (산도 7.8-8.0로 equilibrated)
      2. 15 초 동안 와동. 테이블 톱 m​​icrocentrifuge 절반은 최대한의 속도로 1.5 분 동안 원심 분리기. 감기 에탄올 2.5 권 (245 μL)를 포함하는 새로운 튜브 가기 수성 레이어를 전송합니다.
      3. -80에서 침전물 ° C (30 분. O / N)를.
      4. 4 20 분 동안 원심 분리기 ° C.
      5. 800 μL 70 % 에탄올 (nuclease 무료 물)로 씻어 뜨는와 펠렛을 제거합니다. 완전히 초과 소금을 모두 제거하는 펠렛을 이동시키다해야합니다.
      6. 4 또 다른 20 분 동안 원심 분리기 ° C.
      7. 뜨는 공기 건조 15-20분를 제거합니다.
      8. 4 μL nuclease 무료로 물에 Resuspend 펠릿.
         
         * 샘플은 하룻밤 incubations 동안이 온도에서 동결 수 있습니다. 그것은 이것이 실제로 핵산의 수율을 높일 수 있다고 보여왔다.
4. 2 라운드 첫 번째 가닥 cDNA 합성
   1. • 얼음
      • 1 μL 무작위 primers (0.05 MG / ML) * 추가
   2. 70 열 ° C 10 분. 즉시 적어도 5 분 동안 얼음에 놓으십시오.
   3. • 2 μL 배 첫 스트랜드 버퍼를 추가
      • 1 μL DTT (100 ㎜)
      • 0.5 μL dNTP의 (2.5 MM 각)
      • 0.5 μL RNasin (40 U / μL)
      • 1 μL 윗첨자 III (200 U / μL)
   4. pipetting에 의해 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 10 분 실온에서 앉을 수 있습니다. 이 단계는 반대로 전사 반응이 수행되기 전에 짧은 무작위 primers 연장을 허용해야합니다.
   5. 42 30 분 품어 ° C.
   6. 95에서 열 오분 ° C DNA / RNA 하이브리드의 RNA를 변성 수 있습니다. 적어도 5 분 얼음에 놓습니다. -20 ° C에서 보관 또는 -80 ° C 또는 바로 다음 단계로 진행합니다.
      
      무작위 primers의 * 농도는 중요하다. 농도가 너무 높으면 제품이 더 증폭 각각의 원형과 잘리게됩니다.
5. 2 라운드 두 번째 가닥 cDNA 합성
   1. • 얼음
      • 2 μL T7 -​​ oligo (DT) 프라이머 (μL / 10 NG) * 추가
   2. 70 ° C.에서 5 분 가열 즉시 적어도 5 분 동안 얼음에 놓으십시오. 간단히 스핀.
   3. • 43.5 μL nuclease 무료 물을 추가
      • 15 μL 배 둘째 스트랜드 버퍼
      • 1.5 μL dNTP 혼합물 (2.5 MM 각)
      • 2 μL의 DNA 중합 효소 I (10 U / μL)
   4. pipetting에 의해 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 16에서 2 시간 동안 품어 ° C.
   5. 2 μL T4의 DNA 중합 효소를 (5 U / μL) 추가
   6. pipetting에 의해 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 16 ° C. 10 분만 더 품어
   7. 섹션 6.2.3에서와 같이 Qiagen Minelute 키트를 사용하여 반응을 정리.
   8. 6.2.8에 섹션 6.2.4에서와 같이 Speed​​vac이나 에탄올 침전과 2-4 μL에 집중.
      
      * 첫 라운드 둘째 가닥 cDNA 합성에 비해 T7 -​​ oligo의 다른 주식 농도 (DT) 뇌관을합니다.
6. 시험 관내 전사에서 2 라운드
   섹션 6.3에서와 같이 수행합니다.
   1. 제 번 6.4-6.6 원하는 전화 번호를 반복합니다. 참고 짧은 아르나 제품 증폭 결과 이​​후의 각 라운드. 증폭의 회진의 수는이 이유로 제한해야합니다. 일반적으로 증폭 두 3 라운드는 microarray 분석을 수행하기 위해 하나의 세포에서 수확 자료를 증폭하기에 충분합니다. microarray 분석의 경우, 세 번째 라운드 IVT 반응은 제조 업체의 지침에 따라 같은 Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 다음 microarray 칩에 대한 탐지에 사용되는 아르나에 비오틴 - 라벨 UTP이 통합되어 있습니다.
   2. 나노 RNA 키트 Nanodrop 또는 애질런트 Bioanalyzer를 사용하여 세 번째 라운드의 아르나의 농도를 측정.

7. 대표 결과

기본의 연결을 문화에서 단일 세포의 성공적인 수확은 (그림 1 참조) 적성에 따라, 2 분 미만으로 완료할 수 있습니다. 그러나, 수확에 대한 시간은 시스템 사이의 실험 조작 개입에 따라 달라질 수 있습니다. (그림 4A와 4B 참조) 총 증폭 아르나의 마이크로 그램 금액 결과 아르나 절차에 단일 세포를 쓰는와 bioanalyzer (그림 3 참조) 분석 때 특성 브로드 피크를 생성합니다. 3 라운드는 단일 세포 유전자 표현의 빠른 분석을 위해 수 있도록 세 일 최소에 완료할 수 있습니다.

그림 1. 표시 외딴 신경 세포의 풍작의 예입니다. 우리는 셀상대적으로 낮은 밀도 영역 (A)를 cted하고 원하는 세포 (B)쪽으로 피펫 팁을 고급. 세 번째 이미지 (C)는 세포 이후보기의 필드가 수확했다 보여줍니다. 주변 프로세스가 coverslip에 남아 있습니다.

그림 2. 표시 효과적인 수술을 위해 부적 절한 크기 피펫 팁의 두 이미지입니다. 이 도움말은 불완전 수확 (A)와 (B) 각각 환경 주변의 수확으로 이어질 것입니다.

그림 3. bioanalyzer를 사용하여 다음 수확 및 증폭, 분석 증폭 RNA의 배포 및 수량을 확인하는 것이 좋습니다. 단세포 자료에서 성공적으로 증폭은 낮은 마이크로 그램의 총 금액을 항복하고 부드럽고 폭 배포됩니다.

그림 4. 첫 라운드 (A)와 (B) 아르나 절차의 두 번째 라운드의 회로도가 표시됩니다.

Discussion

노트 및 문제 해결

• 당신은 전후 대상 셀을 격리 것을 보여주는 이미지와 나머지 penumbra가 온전히 남아 있다고 걸릴 수 있습니다.
• 너무 많은 솔루션이 수확 그대로 피펫을 입력하는 경우, 3 Luer - 잠금 피팅 방법과 튜브에 긍정적인 압력을 유지 주사기에 대한 플런저를 사용할 수 있습니다. 원하는 볼륨 처리의 유형에 따라 달라질 수 있지만 최대 5 μl은 대부분의 어플 리케이션을위한 괜찮을 것입니다.

분자 생물 학적 기법에 대한 일반적인 도움말

• 와동 모든 재고 튜브와 반응에 추가하기 전에 그들을 스핀. 절대 와동 효소.
• 철저하게 버퍼가 적절한 농도에 있는지 확인하기 위해 효소를 추가하기 전에 반응을 섞는다.
• 가능하면 stratacooler를 사용하여 -20 ° C에서 효소 주식 보관하십시오. 그렇지 않으면, 바로 사용하기 전에 제거 얼음을 계속하고, -20 ° C. 즉시 반환
• 항상 pipetting 오류를 줄이기 위해 하나 이상의 반응을 준비할 때 주인이 혼합합니다. 샘플의 개수에 따라 필요한 볼륨을 계산하고 10-20%를 추가합니다.
• 스토어 RNA -80 ° C에서 저능아 저하합니다. RNA는 산성 조건에서 발생하는 RNA의 저능아 apurination에 버퍼에 저장되어있는 가장 안정적인 것입니다.

아르나 절차의 일반 개요

그림 4A는 아르나 절차의 첫 번째 라운드를 보여줍니다. 첫 번째 스트랜드 반응에서, T7 -​​ oligo (DT) 프라이머의 폴리 - T 부분은 polyA 꼬리에 바인딩하여 mRNA 종 (길고 흰 사각형)을 선택합니다. 일부 microRNAs는 polyadenylated하고이 프로 시저에 의해 캡처됩니다. 더 중요하지만, 세포에서 가장 풍부한 RNAS, ribosomal RNAS가되지 않습니다. 이 oligo는 템플릿으로 mRNA를 사용하여 cDNA의 보완 스트랜드 (긴 회색 사각형)를 합성하기 위해 역방향 Transcriptase위한 입문서 역할을합니다. T7 - oligo (DT) 프라이머의 T7 부분은 시작 mRNA에 순서 안티 센스와 프레임의 T7 RNA 효소 프로 모터를 포함합니다. 이것은 나중에 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다.

다음, 이전 단계에서 만든 mRNA / DNA 하이브리드의 mRNA는 보온 스트랜드의 DNA 합성에서 만든 오카자키 조각과 유사한 RNA "primers"을 (작은 흰색 사각형) 작성 Rnase H에 의해 부분적으로 분해됩니다. 의 DNA 중합 효소는 한 템플릿으로 mRNA를 보완 DNA를 사용하여 프라임 DNA 합성에 RNA 조각을 사용합니다. 그것이 '3'다음 RNA 조각, 그 5에 도달하면 nuclease 활동 ribonucleotides를 제​​거하고 deoxyribonucleotides으로 그들을 대체합니다. DNA ligase는 선도 가닥의 교체가 완료되지 않은 긴 ligate에 추가됩니다. RNA 조각이 DNA를 중합 효소 내가 만드는 초기 primers 역할을 어디 T4의 DNA 중합 효소는 지역에 채우기 추가됩니다 날이 종단을 두 번 누른 다음 IVT 반응을 수행하기 전에 정화입니다 cDNA 좌초.

IVT 반응에 T7 RNA 효소는 템플릿으로 감지 가닥을 사용하여 두 cDNA 합성 좌초와 안티 센스 RNA 분자 (검고 긴 직사각형)에 반영된 T7 프로 모터에 바인딩합니다. 이것은 안티 센스 RNA 분자의 수천이 각각 두 번 좌초 cDNA 분자 (그림 4A)에서 생산되는 증폭 단계 역할을합니다.

그림 4B에 묘사된 두 번째 라운드는, 시작 RNA 이후 첫 라운드와는 약간 다른 역 전사 반응을 시작하는 안티 센스 (고체 검정 직사각형)이고 T7 -​​ oligo의 대상이되었다 polyadenylated 꼬리 부족 첫 라운드에서 (DT) 입문서. 따라서,이 반응은 임의 primers (작은 회색 사각형)과 이후 변성 RNA와 함께 준비하는 것입니다. 두 번째 스트랜드 반응은 다음 이전 반대 전사 반응에서 만든 감각의 RNA의 3 '끝에 폴리 - A 시퀀스에 바인딩 T7 -​​ oligo (DT) 입문서로 준비하는 것입니다. 다른 IVT 반응은 첫 라운드에서 같은 방식으로 수행됩니다. 이 두 번째 라운드는 일반적으로 하나의 세포에서 증폭의 3 라운드를 달성하기위한 최소한 한 번 반복됩니다.

애플 리케이션

우리는이 문서에서 제시해야하는 기술은 애플 리케이션의 많은로 번역하실 수 있습니다. 단세포 격리 프로토콜은 급성 조각에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. ¹⁴ 기술적으로 많은 도전하지만, 동일한 원칙이 다른 준비에 적용됩니다. 피펫의 크기가 약간 조정 경우 또한, 세포의 생리의 기록은 수확 생리 출력 뒤에 분자 메커니즘을 잘 제어 조사를 위해 허용하기 전에 할 수 있습니다. 또 약간의 수정이 셀 소마에서 프로세스를 분리하는 것입니다.이 응용 프로그램 ¹⁵ 하나의 피펫과 함께 세포의 시체를 수집하고 신선한 피펫로 돌아가서 100-300 식별 dendrit를 수집에스 또는 수집 관 당 axons. ¹⁶

일단 세포는 mRNA의 abundances와 작곡의 비교는 동일한 세포 집단 내에서조차 다른과 사이에 만들 수 있으며, 수확되었습니다. 세 번째 라운드 아르나로 biotinylated - UTP를 통합하면 이러한 상대적인 mRNA의 abundances을 결정하기 위해 microarray 분석을 위해 수 있습니다. 원래 mRNA 인구의 구성 또한 차세대 시퀀싱을 사용하여 아르나 절차 후 결정하실 수 있습니다. 증폭 아르나도 하나의 셀 유형에서 mRNAs의 전체 집합이 이전의에 후자의 셀 타입의 표현형의 전환을 유도하기 위해 다른 세포 유형으로 transfected하는 세포 표현형 변환 연구를 확인하는 데 사용할 수 있습니다 절차는 실험실에서 개발하여 TIPeR으로 알려져 있습니다. ¹⁷ 이러한 연구는 질병 상태 및 세포 phenotypes 및 연구를 공부에 특히 유용합니다 연구실에서 현재 진행하고 있습니다. RT - PCR 또는 qPCR은 셀 - 특정 유전자의 표현을 확인하는 증폭 자료에 수행할 수 있습니다. 또한, transfection 또는 전달의 효율성의 평가는 단일 세포 수준에서 만들 수 있습니다.

장점 및 제한

으로 추상적으로 명시된 바와 같이, 분석을 위해 단일 ​​세포의 분리는 이기종 세포 인구의 분석과 본 평균 효과를 제거합니다. 이러한 평균 효과는 풍부한 기록을 통해 - 대표 밖 평균 많은 낮은 풍부한 성적 증명서의 확인을 방지하여 단일 세포 내에서 mRNA의 abundances를 허위. 유동세포계측법은 개별 세포를 정렬하는 데 사용하지만,이 방법은 세포 특정 마커와 고가의 장비에 대한 지식을 필요로하실 수 있습니다. ¹⁸ 레이저 캡처 microdissection도 자외선 또는 적외선 레이저 캡처 microdissection 시스템과 심지어 단일 셀 및 subcellular 캡처를 허용하지만, 관심의 세포를 필요로 매우 얇은 부분의 표면에 위치합니다. ¹⁹ 유동세포계측법 마찬가지로, 레이저 캡처 microdissection은 값비싼 장비가 필요합니다.

위에서 설명한 전극을 기반으로 수집 기술의 주요 장점 중 하나는 귀중한 electrophysiological 데이터가 동일한 세포에서 수행하는 기능과 transcriptome 분석을위한 허용, 수확하기 전에 관심있는 세포에서 얻을 수있다. 우리의 기술 ²⁰ 단점입니다 그것은 micromanipulators를 사용하여 경험을 필요로 않습니다. micromanipulators 익숙한 수사관이 기술은 매우 직관적인 발견할 것이다, 그러나, 이러한 경험을 가진 개인은 필요한 좋은 움직임과 함께 편안한 될해야합니다.

모든 증폭 기술 고유의 크기와 염기 조성에 따라 특정 성적의 특혜 증폭입니다. ^4,6,7 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)과 같은 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (RT - PCR) 및 cDNA의 급속한 증폭과 같은 기반 기술 성적 지수 증폭에 종료 (RACE) 결과, 선형 증폭의 반면 아르나의 증폭 절차 결과. 따라서 아르나 절차의 주요 장점 중 하나가 더 나은 유일한 선형 기하 급수적으로 확장 반대로 증폭 과정에서 발생하는 오류나 편견을 확장하여 mRNA의 성적의 상대적 abundances를 보존하는 기능에있다 오류와 편견했다.

microarray 분석과 동봉된 아르나 절차는 치료 또는 치료 유사하거나 다른 형태의 단일 셀 사이의 mRNA의 abundances의 비교를위한 수 있습니다. 또한 증폭 자료는 차세대 시퀀싱을위한 제출하실 수 있습니다. ^5,8는 그러나, 프로 시저에 대한 무작위 primers를 사용하는 반면에, oligo - DT 준비하는 절차는의 편견 증폭 위에서 설명한 이후 같은 분석에 관심 기울여야 3 '은 mRNA 각각의 원형과 그 이후 증폭된 소재의 약간의 단축에 일반적으로 결과의 끝납니다. 치료는 몇 가지 잘못된 부재 통화가 약간 짧아 증폭 소재에서 발생할 수있는 표준 방법으로 microarray 결과를 분석에 주의해야한다. 또한, 시퀀싱하면서 결과가 실제로 전체 5 제공할 것입니다 '원래의 mRNA 대부분의 순서를 5'일부 mRNA의 시퀀스는 놓칠 수 있습니다. 이러한 이유로, amplifications의 반올림의 수를 제한해야합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511