המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Summary

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

Abstract

המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence.

מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג'ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג'ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג'לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג'ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג'ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה).

ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג'ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.

Protocol

ג'ל אלקטרופורזה

הערה טכנית: לפני שמתחילים את ההליך, יש דגימות חלבון שלך מוכן.

במהלך שלב זה הראשון, החלבונים במדגם מופרדים על פי משקל מולקולרי שלהם באמצעות denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). ® NuPAGE הצפת LDS לדוגמה עמוסה סולפט Dodecyl ליתיום (LDS) שומרת פוליפפטידים במצב מפוגל פעם המדגם חלבון כבר מחוממת על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סוכן הפחתת חזקה משמש יחד כדי להסיר מבנה משניים ושלישוניים (DTT, לשבור אג"ח דיסולפיד). בנוסף, חלבונים מדגם להיות מכוסה LDS טעונים שלילית ולכן עוברים דרך הרשת acrylamide של הג'ל לכיוון האלקטרודה במטען חיובי. זה מאפשר הפרדה שלהם על פי משקל מולקולרי (נמדד קילו Daltons, KDA).

מפורט צעד אחר צעד פרוטוקולים להכנת הדגימה את ההליך PAGE ניתן למצוא באתר האינטרנט של Invitrogen ^2, או הטכני NuPAGE מדריך ^3.

טכנית טיפים

1. במערכת NuPAGE Invitrogen ביס, טריס חיץ discontinous, הניידות electrophoretic של חלבונים ואת טווח ההפרדה הבאות של הג'ל תלויה בשני גורמים: א) ריכוז acrylamid של ג'ל (עם ריכוז acrylamide יותר וכתוצאה מכך ברזולוציה נמוכה יותר של משקל מולקולרי חלבונים) ו ii) של יון נגרר למאגר, מגבים ריצה או MES. כדי לבחור את השילוב המתאים למגוון ההפרדה שאתה רוצה להשיג, עיין בתרשים הגירה ג'ל ^1. העובי של ג'ל ומספר בארות תהיה תלויה בנפח וכמות דגימות שבכוונתך לטעון, בהתאמה.
2. בעת טעינת דגימות שלך לתוך בארות של ג'ל, לפחות נתיב אחד שמורה סמן משקל מולקולרי (או הסולם). סטנדרטים אלו חלבונים זמינים מסחרית של מספר חברות, ובדרך כלל מכילים תערובת של חלבונים מוכתם לאחר משקולות מולקולרי מוגדר, כדי ליצור להקות גלוי המאפשרים לך לעקוב אחר התקדמות ההגירה. בחר טווח המשקלים המולקולריים תואם ברזולוציה ג'ל שלך.
3. כדי להשיג דפוס הגירה נחמד ואפילו מומלץ טוען את כל הבארות של ג'ל עם נפח דומה של מדגם או 1X חיץ LDS המדגם.

להעביר

הערה טכנית: לפני תחילת שלב העברה, להכין את החיץ ההעברה (1X עם מתנול 10%) מראש מגניב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר.

על מנת להפוך את החלבונים נגיש לאיתור נוגדנים, הם מועברים על ידי electroblotting מן הג'ל על גבי קרום nitrocellulose. מחייב חלבון מבוססת על אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם יחסי הגומלין בין תשלום הממברנה וחלבונים.

(קרום polyvinylidene (PVDF) פלואוריד יכול לשמש גם כאלטרנטיבה. במקרה זה, את הממברנה PVDF צריך להיות מראש רטוב מתנול 30 שניות לפחות לפני השימוש.)

פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד של הליך העברת ניתן למצוא התייחסות 4 אם אתה משתמש Bio-Rad מיני חוצה כתם Cell העברת Electrophoretic, או הפניות 2-3 אם המעבדה שלך מצויד II XCell Invitrogen של ™ כתם Module.

כתוצאה מתהליך זה, חלבונים נחשפים על פני השטח בשכבה דקה מוכן לצורך זיהוי. האפקטיביות אחידות הכוללת של העברת חלבון מן הג'ל על הממברנה ניתן לבדוק על ידי מכתים קרום לצבוע Ponceau S הפיך.

מכתים הליך Ponceau S (אופציונלי):

1. לאחר העברת חלבונים, במקום קרום במגש הדגירה (חלבונים פונה כלפי מעלה).
2. הוסף מספיק מכתים S Ponceau כדי לכסות את הממברנה לדגור לפחות 30 שניות עם תסיסה עדינה.
3. יש לשטוף את הממברנה עם מים מזוקקים עד רקע ברור.
4. Destain הממברנה עם ריצה מים מזוקקים במשך 2-3 דקות.
5. מניחים את קרום פתרון חסימה (ראה להלן).

טכנית טיפים:

1. אנו ממליצים תיוג קרום שלך בעיפרון לפני העברת חלבון כדי לציין את הצד שבו חלבונים נחשפו הכיוון של דגימות שלך.
2. שני מכתים S Ponceau ואת הסמנים משקל מולקולרי ניתן להשתמש כדי לחתוך את הקרום לאחר העברת לחקור את החלקים וכתוצאה מכך עם נוגדנים שונים

Immunodetection:

הערה טכנית: הליך זה immunodetection מסופק כקו מנחה בלבד. אופטימיזציה עשויות להידרש כל נמלהibody; מידע ספציפי ניתן למצוא את רוב גליונות נתונים של נוגדנים זמינים מסחרית (לדוגמה, עובד דילול, זמן הדגירה, וכו ').

במהלך תהליך זה האחרון, היעד החלבון יזוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים יופיעו כלהקה על הסרט. העמדה של הלהקה תלוי במשקל המולקולרי של חלבון המטרה, ואילו עוצמת הלהקה תלוי בכמות של ההווה חלבון המטרה.

בדרך כלל, זה הושג לאחר שלוש substeps:

1. חסימה: כדי למנוע הלא ספציפית של הנוגדן אינטראקציות עם קרום (הרווח העודף על הממברנה מכוסה בתמיסה מדוללת של חלבון גנרית).
2. גשוש: החלבון של עניין הוא זוהה על ידי ספציפית נוגדן ראשוני . לאחר נוגדן מאוגד העיקרי הוא נשטף, הממברנה חשופה נוגדן אחר קשור לכתב האנזים , peroxidase חזרת (HRP). נוגדן זה משני מופנית כנגד חלק מינים ספציפיים של הנוגדן הראשוני (למשל, נוגדן נגד ארנב משני יהיה לאגד את כל הנוגדנים, ארנב שמקורו העיקרי).
3. גילוי: סוכן chemiluminescent משמש מצע אשר luminesce כאשר הם נחשפים HRP על נוגדן המשני. תגובה זו מייצרת הארה במקומה ביחס לכמות החלבון נחקר. האור מזוהה ולאחר מכן על ידי סרט הצילום.

הליך הגנרית צעד אחר צעד מוצג להלן. נהלים מפורטים נוספים ניתן למצוא במדריך ריאגנטים ECL פלוס המערבי סופג הוראה איתור ⁵ או ברוב גיליון הנתונים הנלווה נוגדנים זמינים מסחרית. זמן דגירה, דילול נוגדן, וחסימת ופתרונות לשטוף צריך להיות מותאם באופן אמפירי את כל הנוגדנים.

Immunodetection ההליך:

1. חסום את הכריכה הלא ספציפית על ידי דוגרים עם נפח מספיק של פתרון קזאין PBS 1% חסימת כדי לכסות את הממברנה כולה. מניחים על כיסא נדנדה דקות לפחות 30 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
2. דגירה הממברנה עם הנוגדן הראשוני שלך (ספציפית לחלבון של עניין). הנוגדן העיקרי צריך להיות מדולל חסימת פתרון. עבור רוב הנוגדנים, מחייב להשלים מושגת לאחר דגירה 1-2 שעות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לחילופין, בשלב הדגירה יכול להתבצע בין לילה ב 4 ° C כדי להגדיל את יחס אות לרעש.
3. הסר את הפתרון (לזרוק או לשמור על 4 ° C ל -20 ° C לשימוש חוזר) ובמהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBS, 0.05% Tween 20 (PBST) בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת.
4. דגירה הממברנה עם נוגדן HRP מצמידים משנית מדולל חסימת פתרון. בחר נוגדן אשר מזהה את החלק IgG של המין שבו נוגדן ראשוני הועלתה. הדגירה מתבצעת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה.
5. מחק את הפתרון במהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת.
6. המשך איתור chemiluminescent בהתאם להוראות היצרן. אנו משתמשים ריאגנטים ECL פלוס המערבי איתור סופג מן GE Healthcare (ראה התייחסות 5 הוראות ספציפיות).
7. המקום קרום שלך בניילון נצמד או שקית ומניחים בתוך קלטת autoradiography. הקפידו לרוקן כל נוזל עודף ולהסיר את כל בועות האוויר.
8. לחשוף את סרט הצילום קרום בחדר חשוך. התחלה עם זמן חשיפה 1 דקה ולהתאים לפי עוצמת האות הרצויה.

טכנית טיפים:

1. חסימת מחייב הלא ספציפית מושגת על ידי הצבת קרום בתמיסה מדוללת של חלבון. אנו משתמשים בדרך כלל קזאין 1%, אך שור אלבומין בסרום (~ BSA 2%) או שאינם שומן חלב יבש (~ 5%) יכול לשמש כחלופה.
2. טריס שנאגרו מלוחים (TBS) ניתן להשתמש בכל ההליך במקום PBS. אנו ממליצים להשתמש כפות אם בכוונתך בדיקה הממברנה עם נוגדן phosphospecific.
3. השימוש זוהר-in-the-כהה מדבקה (לדוגמא, Glogos של Stratagene ® II סמנים Autorad) טפח בחלק התחתון של הקלטת autoradiography יעזור לך ליישר הסרט שלך קרום שלך במהלך שלב הניתוח.

אנליזה

עכשיו שיש לך חשוף הסרט שלך, אתה תבין כי מבחינה מעשית, לא כל מערבונים לגלות חלבון כלהקה אחד נחמד. Additionaלהקות אני יכולה להופיע גם עקב מחייב הלא ספציפית של נוגדנים הן יסודי ותיכון. אות זה הרקע יכול להיות מופחת על ידי אופטימיזציה של תהליך immunodetection. בנוסף, פקד המתאים (למשל, תאים untransfected, siRNA שטופלו בתאים, וכו ') יהיה שימושי כדי לקבוע את הספציפיות של נוגדנים שלך את המיקום המדויק של חלבון המטרה על הממברנה.

לאחר סימון על הסרט את המיקום של תקן להקות מוכתמים בחלבון מן הקרום, העלילה יומן של כל משקל מולקולרי של תקני חלבון (ציר y) נגד ניידות יחסית המתאימים (ציר x). ניידות יחסית (RF) הוא מונח המשמש עבור יחס המרחק החלבון עבר מנקודת המוצא שלו (החלק העליון של הג'ל) ביחס למרחק לצבוע מעקב או סמן נמוך משקל מולקולרי עברה (הקדמי ג'ל) . קביעת קו רגרסיה של עקומת סטנדרט להשיג ערכים עבור השיפוע-y ליירט. משקל מולקולרי ידוע (גודל) של חלבון היעד שלך נאמד באמצעות Rf שלו שונה המשוואה הבאה:

יומן משקל מולקולרי = (שיפוע) (ניידות או Rf של חלבון המטרה) + Y-ליירט

(ראה התייחסות 6 לקבלת הוראות מפורטות).

רמת הביטוי קירובים נלקחים על ידי השוואת עוצמת הלהקה של חלבון היעד של חלבון מבנית (למשל, טובולין או אקטין) או גן משק המוצר כגון GAPDH. זה מה שנקרא "שליטה טוען" לא צריך לשנות בין דגימות מתגלה באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי. התמונה עשויה להיות מנותח על ידי צפיפות נוסף כדי להעריך את כמות יחסית של חלבון מכתים ולכמת את התוצאות במונחים של צפיפות אופטית.

Discussion

הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג'ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג'ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג'לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate ג'ל). בהתאם הניסוי שלך, אתה יכול לבחור לעקוב רק חלק הטכניקה המערבי סופג המתואר כאן שימוש ישיר מכתים ג'ל ההליכים (למשל, כסף או מכתים Coomassie) או שיטת immunodetection חלופי (למשל, colorimetric או פלורסנט).

אנו מרבים NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה במעבדה שלנו עבור יישומים שונים, שחלקם דוגמאות ניתן למצוא הפניות 7-9.