Summary
Nós descrevemos um protocolo de observar e analisar as trajetórias de células rolando no assimétrica receptor-padrão substratos. Os dados resultantes são úteis para a engenharia de receptor-padrão substratos para a etiqueta livre de separação de células e análise.
Abstract
Deslocamento lateral de células ortogonais a um fluxo fluxo rolando sobre os padrões assimétricos receptor apresenta uma oportunidade para o desenvolvimento de novos dispositivos para a etiqueta livre de separação e análise de células 1. Tais dispositivos podem utilizar deslocamento lateral para separação de fluxo contínuo, ou padrões de receptores que modulam a adesão ao distinguir entre fenótipos celulares diferentes ou níveis de expressão do receptor. Compreensão da natureza das trajetórias de células rolando no receptor-padrão substratos é necessária para a engenharia dos substratos e desenho de tais dispositivos.
Aqui, nós demonstramos um protocolo para o estudo de trajetórias de células rolando sobre os padrões de receptor assimétrica que suporte adesão celular rolando 2. Bem definida, M escala padrões de P-selectina receptores foram fabricados utilizando a impressão em microcontact revestidas de ouro slides que foram incorporados em uma câmara de fluxo. HL60 células que expressam o ligante PSGL-1 3 foram fluiu através de um campo de linhas de estampados e visualizadas em um microscópio de campo invertido brilhante. As células laminadas e monitorados ao longo das bordas inclinadas dos padrões, resultando em um deslocamento lateral. Cada célula tipicamente enrolada por uma certa distância ao longo das bordas padrão (definido como o comprimento de rastreamento borda), individual a partir da borda, e recolocado a um padrão de downstream. Embora essa separação torna difícil acompanhar toda a trajetória de uma célula de entrada até a saída da câmara de fluxo, de partículas de rastreamento de software foi utilizado para analisar e produzir as trajetórias de rolamento das células durante o tempo em que eles estavam se movendo em um único receptor com estampas de linha. As trajetórias foram então analisados para obter distribuições de velocidades de rolamento de células e os comprimentos borda de rastreamento para cada célula de padrões diferentes.
Este protocolo é útil para a quantificação de células trajetórias rolando sobre os padrões de receptor e relacionando estes parâmetros de engenharia para como padrão e ângulo de tensão de cisalhamento. Esses dados serão úteis para o design de dispositivos microfluídicos para a etiqueta livre de separação de células e análise.
Protocol
1. HL60 célula rolando
1.1. Fabricação de Patterned Substratos.
- Utilizando a impressão microcontact (μCP) 4-7 para fazer alternando monocamadas auto-organizadas (SAMs) de moléculas de PEG nas lâminas de vidro revestidas de ouro: Fabricar microcontact impressão PDMS (polidimetilsiloxano) selos que definiu os padrões de receptor com ângulo de inclinação de α = 10 ° por um SU-8 processo de moldagem. Limpe a superfície de ouro com a solução de piranha (3:1 mistura de ácido sulfúrico a 30% de peróxido de hidrogênio) por 20 minutos e depois enxaguar a superfície com água abundante DI de 24,5 ° C antes do uso. Tinta do carimbo PDMS com solução de PEG 5mM em etanol. Seque o selo no ar por 20 minutos. Gentilmente colocou o selo na superfície de ouro por 40 segundos e verifique se há um bom contato entre a superfície do ouro e do carimbo. Sem excesso de pressão é necessária. Enxaguar a superfície com o etanol e seque-o sob um fluxo de N 2.
- Incubar o substrato dentro da P-selectina solução (15 mg / mL em DPBS), utilizando uma câmara de perfusão (Ciências Microscopia Eletrônica) durante 3 horas a 24,5 ° C para o padrão de áreas remanescentes com a P-selectina. Enxaguar a superfície com DPBS copiosa.
- Aterrar a superfície com BSA (1 mg / mL em DPBS) por 1 h para bloquear interacções não específicas. Enxaguar a superfície com DPBS copiosa.
1.2. Célula do Rolling Experimentos em uma Câmara de Fluxo.
- Fluxo de uma suspensão de células HL60 (~ 10 5 células / mL) sobre as superfícies estampados em uma câmara de fluxo retangular (Glycotech, Inc; largura w = 1,0 cm, comprimento = 6 cm, altura h = 0,0127 centímetros) de 24,5 ° C. Use uma bomba de seringa (Instrumentos de Precisão Mundial, SP230IW) para gerar fluxo de 75 mL / min, com tensão de cisalhamento correspondente cerca de 0,5 dyn / cm 2 (~ 0,05 Pa). Calcular tensão de cisalhamento τ usando a equação de fluxo de Poiseuille plano τ = 6μQ/wh 2, onde μ é a viscosidade cinemática (0,001002 Pa s), Q é a taxa de fluxo volumétrico, w é largura da câmara de fluxo, e h é a altura do câmara de fluxo.
- Use um microscópio invertido (Nikon TE2000-U) com uma câmera montada (Andor ixon 885) para gravar as células HL60 rolando interações com adesivo P-selectina substratos usando um 4 × objetivo, normalmente a uma taxa de 1 quadro por segundo para as durações de 300 s. Realizar três experimentos independentes, para cada magnitude tensão de cisalhamento e ângulo de inclinação padrão. Apresentar dados como média e desvio padrão dos valores médios obtidos para cada experimento.
- Análise de Dados.
Analisar as seqüências de imagens por um programa personalizado Matlab (Mathworks, Inc.) que utilizaram uma partícula de rastreamento 8 freeware para gerar faixas ao longo das bordas da linha padronizada. Faixas estendendo até o fim de uma banda de P-selectina são selecionados e equipado com dois segmentos de reta - um alinhado com o fluxo, a outra alinhada com a borda padrão. Estes dois segmentos são então usadas para calcular o comprimento de rastreamento borda, rolando velocidade na borda, e rolando de velocidade na região simples.
2. Resultados representativos:
Figura (A) mostra uma das imagens de microscopia convertido a partir do vídeo de HL60 interações rolando com adesivo P-selectina substratos usando um objetivo × 4. Regiões claras e escuras correspondem a P-selectina receptor e regiões PEG, respectivamente. Figura (B) mostra as faixas obtidas utilizando um programa Matlab personalizada. O ângulo de inclinação borda foi de 10 ° ea tensão de cisalhamento foi de 0,5 dyn / cm 2. O comprimento de rastreamento de ponta, e l, o deslocamento, d, e as velocidades de rolamento na borda e no interior das bandas, e V e V p, respectivamente, estão descritas na Figura (C-1). Figura (C-2) mostra a distribuição (o número de células gravadas) de comprimento rastreamento borda. Inserções mostram o valor médio de l e e da velocidade de rolamento na ponta (V e) e no interior das bandas (V p) no ângulo de inclinação α = 10 ° ea magnitude de estresse fluido de corte em torno de 0,5 dyn / cm 2. Barras de erro representam um desvio padrão, onde n = 3 experimentos replicar (3 superfícies replicar) para cada condição.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo para examinar células trajetórias rolando no assimétrica receptor-padrão superfícies fabricados utilizando a impressão microcontact 2. As imagens do microscópio óptico da superfície modelada mostrando claro contraste entre PEG e P-selectina áreas podem ser usados para confirmar se a impressão é bem sucedida. Sharp, bordas retas pode ser observado quando a estampagem é feita assim. Duro pressionando do selo pode resultar em deformação do selo que limita a precisão dos padrões. Bordas onduladas podem ser obtidas quando a concentração de tinta é muito alta ou o tempo de estampagem é muito longo. Mau contato entre o selo ea superfície leva a padrões não-uniforme PEG quando o tamanho do selo é muito pequeno (<0,5 cm 2). Não-solução de tinta fresca pode resultar em células rolando nas regiões PEG-padrão por causa da diminuição da capacidade de passivar P-selectina. O ângulo de inclinação real pode ser calculado a partir de imagens do padrão e trajetórias de fluxo livre células que não estão interagindo com as superfícies. O experimento descrito aqui produz informações sobre célula individual eventos rolando ao longo das bordas padrão, no entanto, é difícil rastrear automaticamente as células que destacar em um padrão e voltar a ligar em outro padrão. Alterar o espaçamento padrão, por exemplo, pode habilitar o rastreamento de uma única célula encontrando várias arestas. Esta habilidade pode permitir maior resolução para distinguir entre as células com diferentes características rolando no nível da célula única. Como o comportamento das células de rolamento depende da ligantes na célula, temos a hipótese de que tais experiências pode permitir desenho de padrões adequados para separar fenótipos celulares diferentes com base em diferenças no seu comportamento rolling 3, 9-12. Este trabalho pode assim ser útil para o design de dispositivos para separação de células e análise com base na interação entre ligantes e receptores de células padrão assimétrico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado pelo Centro Deshpande para a Inovação Tecnológica no MIT (RK e JMK) ea concessão de CARREIRA NSF 0952493 para RK através do programa de Química e Biológica Separações. Agradecemos ao Instituto de Nanotecnologias Soldier (ISN) ea Microsystems Technology Laboratory (MTL) no MIT para utilização de suas instalações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
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