Summary
وكشف اثنان الفوتون التصوير حركية اللمفاويات والتفاعلات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية خلال استجابة مناعية 1. هنا ، علينا أن نظهر نقل بالتبني من الخلايا التائية ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة التصوير من خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted.
Abstract
وقد كشف اثنان الفوتون تصويري شامل للالكوريغرافيا أنيقة من حركية والتفاعلات الخلوية في العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية في بدء استجابة مناعية 1. هنا ، فإننا نقدم طرق لنقل بالتبني من الخلايا التائية المسمى ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة من التصوير خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted كما هو موضح الأولى في عام 2002 2. التصوير ثنائي الفوتون من الخلايا المناعية التي تتطلب fluorescently المسمى الخلايا ، إما عن طريق تلوين مع خلية الصبغة أو تعقب بالإعراب عن بروتين فلوري. علينا أن نظهر للإجراءات نقل بالتبني من الخلايا المشتقة من حقن الفئران المانحة في الوريد ذيل الحيوان المتلقي ، حيث أنها موطن لأجهزة اللمفاوية ضمن 15-30 دقيقة تقريبا. نوضح العزلة من العقدة الليمفاوية وتصف وسائل لضمان التركيب الصحيح للالعقدة الليمفاوية استئصاله. وتناقش اعتبارات أخرى مثل الأوكسجين المناسب من وسائل الإعلام perfused ودرجة الحرارة وقوة الليزر. وأخيرا ، فإننا نقدم لصور الفيديو 3D CD4 + الخلايا التائية السذاجة العارضة المطرد حركية الدولة في 37 ° C.
Protocol
1. نقل بالتبني من الخلايا :
الذيل الوريد أو حقن العين كلاهما الطرق المناسبة لتطبيق تعقب الخلية التي تحمل علامات أو التعبير عن بروتين فلوري الخلايا الليمفاوية. في هذا الفيديو. نظهر نقل بالتبني من الخلايا عن طريق الحقن في الوريد الذيل.
أ. المواد
تغسل CD4 + المسماة الخلايا التائية مع 1.4 ميكرومتر CFSE لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مرتين ، وإعادة علقت في 100 ميليلتر من RPMI - 1640. يتم تحميل الخلايا في المحاقن المعقمة 28 قياس الانسولين عن طريق الحقن. عدد الخلايا المستخدمة يعتمد على يجري التجربة. عادة ، 5 ملايين الخلايا التائية بسيطة تكفي لتصور الخلايا التائية. وثمة حاجة إلى restrainer القوارض للماوس لمنع إصابة الحيوان ولنفسك.
ب. تأمين الحيوان
يتم تأمين الماوس لنقل بالتبني من خلال دعم ببطء الحيوان في restrainer القوارض (انظر الفيديو) وإغلاق النهاية المفتوحة للأنبوب بالضغط بلطف المكبس. لا يتخلين عن ذيل الماوس أثناء هذه العملية ، حيث أن بعض الحيوانات الصغيرة يمكن أن تتحول نحو داخل restrainer. هذا الأسلوب يمنع الحيوان من اصابة نفسها وتتحرك من خلال الحقن. عند إعداد restrainer القوارض ، لا دفع المكبس في أبعد مما هو ضروري للحفاظ على الحيوانات من القفز إلى الأمام. أيضا ، لا دفع المكبس ضد الحيوان ، وعدم ترك الحيوان في restrainer لفترة ممتدة من الزمن.
ج. تصور السياق الذيل
برفق نحو الذيل لك بحيث يتم التفاف طفيفة عليه أكثر من إصبع السبابة الخاص وعقد ضد من الداخل بواسطة إصبع الإبهام. التعرف على الأوردة ذيل تقع على جانبي الذيل في وضع مستقيم. ومما يسهل التصور عن الاحترار الذيل بالماء الدافئ ، ثم مسح أسفل مع الايثانول.
د. حقن الخلايا
عندما تم تحديد موقع الوريد ، تضاف شطبة حقنة من جانب مواز يصل في زاوية الضحلة إلى الوريد. مرة واحدة في هذا السياق ، خفض بلطف الغطاس ، وإذا كنت في هذا السياق ينبغي أن يكون هناك أي مقاومة للحقن. إذا كان هناك أي مقاومة ، وإزالة المحقنة وحاول مرة أخرى في موقع مختلف.
إذا كنت في هذا السياق ، خفض ببطء الغطاس حتى اكتمال الحقن. يجب أن لا تصبح منتفخة الذيل خلال الحقن. إذا كان الأمر كذلك ، فإن هذا يعني أن إبرة ليس في الوريد. فمن الممكن أن "فقدان" في الوريد خلال الحقن. إذا حدث هذا ، إزالة الإبرة وحاول الحقنة في مكان مختلف. إذا كنت في حاجة لمحاولة أكثر من حقنة واحدة ، فمن الأفضل لتحريك الذيل يصل نحو جسم الفأر من موقع الحقن الأصلي. تخطط للمستقبل لهذا الاحتمال من خلال البدء بشكل أقصى على الذيل أن تعطي لنفسك مجالا لمحاولة أخرى لنقل بالتبني.
ه. بعد حقن الاعتبارات
بعد الانتهاء من الحقن ، وسوف صغير يعود تدفق الدم من الوريد تحدث. اضغط بلطف موقع الحقن مع مسح نظيفة ، وحتى يتوقف النزيف. إزالة المكبس ، والسماح للحيوان السير إلى الأمام ، للخروج من restrainer ، بينما يمسك بلطف على الذيل.
الاختيار دائما مع الخاص جنة رعاية الحيوان والبروتوكولات استخدام الحيوانات للتأكد من وجودك في الامتثال. من المهم أن ممارسة هذا الأسلوب عدة مرات قبل محاولة التجربة الحقيقية.
2. العقدة اللمفية العزل
عزلة الغدد الليمفاوية للتصوير الفوتون two يتطلب إزالة حذرا من العقدة الليمفاوية الصحيحة من الأنسجة المحيطة بها.
أ. اختيار ومكان الغدد الليمفاوية الطرفية
واختيار الغدد الليمفاوية للتصوير تعتمد على أهداف تجريبية. يكون على بينة من عدوى محلية أو الحقن تجفيف الغدد الليمفاوية ، وحدد العقدة المناسبة للتصوير. المقالة التي كتبها فان دن Broeck وآخرون ، ويصف موقع ومورفولوجية الغدد الليمفاوية الفئران بالتفصيل 3. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح الختان ستة كبيرة الغدد الليمفاوية الطرفية التي هي مناسبة لعزل الخلية أو التصوير.
ب. إزالة العقدة الليمفاوية :
نأخذ في الاعتبار سلامة الأنسجة مع إزالة الغدد الليمفاوية. يجب الحرص على عدم القطيعة الكبسولة أو في أي ضرر الطريقة بنية العقدة الليمفاوية. وفقدان النزاهة العقدة الليمفاوية التسوية الهيكلية التجربة. إذا لزم الأمر ، وإزالة الدهون من سطح العقدة الليمفاوية مع غرامة ملقط تشريح (# 5 دومون) تحت مجهر تشريح. وينبغي أن الغدد الليمفاوية ليس لديها أي الدهون المتبقية على سطح العقدة ، لأن هذا سوف تحجب التصوير التي تشتت الضوء.
استئصال الغدد الليمفاوية السليم هو أيضا مهم لممارسة أسلوب قبل التجربة الحقيقية الأولى.
3. الليمفاوية الإيماءةه التصوير إعداد واعتبارات
وينبغي تأمين العقدة الليمفاوية الى مرحلة التصوير ، وهو في هذه الحالة يتكون من غرفة راحة. ويتم ضخ تحسنت ، والأكسجين ، perfused الوسائط في الغرفة من جانب واحد باستخدام مضخة تمعجية وسخان المضمنة ، وخروجها عبر قناة متدرج نحو الانخفاض ، في غرفة جمع مع فراغ أنبوب لجمع النفايات القارورة. في نظامنا ، الغارقة في العقدة الليمفاوية في 37 درجة مئوية وسائل الإعلام وفائقة perfused مع كربوجين الصف الطبية (5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ O 2). يجب أن تسجل درجة الحرارة في وسائل الاعلام نضح أقرب إلى العقدة الليمفاوية ما هو ممكن. قد يتطلب النظام الخاص بك ولا سيما التغيرات في معدل تدفق وسائل الإعلام ومرحلة التصميم لاستيعاب المرحلة المجهر وموضوعية.
أ. العقدة الليمفاوية الإعداد والتصوير :
كما يظهر في شريط الفيديو ، ونحن أمنا العقدة الليمفاوية عن طريق ربط لأول مرة ، من جانب النخاعية أسفل (صورة لخلية تي أو مناطق B باستخدام المجهر تستقيم) إلى ساترة البلاستيك ، وقطع إلى الحجم المناسب. من المهم استخدام الغراء الأنسجة غير سامة (نستخدم VetBond ™ من شركة 3M).
يتم تأمين ساترة في وسائل الإعلام التي تتدفق من خلال وضع لمسة صغيرة من الشحوم سيليكون على الجانب السفلي من انزلاق الغطاء ، ثم وهذا الالتزام إلى قاعدة من الزجاج للغرفة التصوير.
ب. 2 فوتون الاعتبارات التصوير :
ويمكن لعوامل عديدة تسبب الخلايا الليمفاوية لوقف التحرك : درجة الحرارة التي هي مرتفعة جدا أو منخفضة جدا ؛ فائض قوة الليزر ؛ ضغط أو أضرار أخرى إلى العقدة الليمفاوية ، ونقص الأوكسجين. الضرر الناجم عن قوة الليزر أو درجات الحرارة المفرطة> ~ 39 درجة مئوية لا رجعة فيه.
إذا الخلايا قاتمة ، فمن الأفضل عادة لزيادة الحصول على كشف الخلية أو بروتوكول وضع العلامات بدلا من استخدام القوة العالي ليزر لتصور الخلايا. قد تكون هناك حاجة لوضع العلامات التحسين أو التعبير عن البروتينات الفلورية لجلب مضان فوق مستوى الخلفية تألق ذاتي. مع زيادة معقولة وإعدادات الطاقة الليزر ، وتحولا نحو عامين سجل لمضان فوق خط الأساس (يقاس التدفق الخلوي) هو التصور المعقول للخلية.
مع الليزر ثنائي الفوتون الانضباطي ، ينبغي أن تستخدم لإثارة موجة تكون أقل قليلا من ضعف الحد الأقصى الإثارة واحدة من الفوتون fluorophore التي يجري تصويرها. في اثنين من الفوتون التجارب باستخدام أكثر من تسمية واحدة أو بروتين فلوري قد يكون من الضروري لهذه التجربة مع موجة الإثارة استخدامها للعثور على الإعدادات المثلى لكل من التسميات. ويمكن أيضا إثارة ثنائي الفوتون يمكن استخدامها لهياكل صورة الكولاجين الذاتية عن طريق الاستفادة من الجيل الثاني الزرقاء الجوهرية التوافقي. الجيل الثاني التوافقي (SHG) يحدث حيث يتم الجمع بين اثنين الفوتونات ضمن المواد وتنبعث من فوتون واحد من تردد مرتين من الفوتونات الأصلي. في الأنسجة ، واثنين من الفوتون الإثارة يحدث عندما يكون هناك ضوء الليزر الحادث هو عمودي على بنية البروتين أمر غاية مثل الكولاجين.
وتمت مناقشة القضايا العملية المتعلقة اثنين الفوتون التصوير في الاستعراضات معاينة 4 ، 5.
Discussion
في هذا البروتوكول الفيديو نظهر الإجراءات لنقل الخلايا الليمفاوية بالتبني وعقدة العزلة والتحضير اللازم لمفاوية حركية التصوير في العقدة الليمفاوية الطرفية. ثنائي الفوتون التصوير ديها العديد من المزايا أكثر من التصوير في كل من أنسجة مبائر explanted (كما هو موضح هنا) وintravital في التحضيرات. خصوصا ، واستخدام الأشعة تحت الحمراء يقلل الإثارة تشتت الضوء وتسمح للتصوير ~ 300 ميكرومتر تحت الكبسولة من العقدة الليمفاوية وأعمق في بعض الأنسجة 4. وعلاوة على ذلك ، يقتصر متعدد الفوتون الإثارة إلى النقطة المحورية لهذا الهدف ، وتبيض الصورة تقليل تلف الأنسجة من جانب الطائرة التنسيق. كما هو الحال مع أي تقنية جديدة ، ومع ذلك ، واثنين من الفوتون التصوير ليست حلا سحريا ، ويجب أن تبقى حدودها والمزالق المحتملة في الاعتبار 5. بين هذه هو شرط ذلك -- باستثناء اشارات الجوهرية مثل الجيل الثاني التوافقي بواسطة خلايا الكولاجين الفائدة يجب أن تكون التحقيقات التي fluorescently المسمى خارجي أو من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية. وبالتالي يتم إنشاء الانطباع بأن هذه الخلايا هي المسمى السباحة في فراغ أسود ، بينما في الحقيقة هي أنها منغمسة في ، والتفاعل مع بيئة معقدة من العناصر الهيكلية وغيرها غير المسماة لا تعد ولا تحصى ، والخلايا غير مرئية.
في السنوات الست منذ بدء اثنين من الفوتون التصوير لالمناعة ، وسمحت هذه التقنية الباحثين لمعالجة طويلة الأمد الأسئلة التي تصور بشكل مباشر في سلامة الأنسجة الحية بما في ذلك عمليات الخلية خلية التفاعلات ، وحركية الخلية والتوطين ، مما يشير مسارات الخلوية السامة للخلايا والخلية مقتل الأحداث. وقد تطورت بسرعة تتجاوز مجال توصيف الظواهر الأولية ، والتحليل الكمي مع النمذجة والمحاكاة الكمبيوتر بدأت الآن لفهم كيف أن الحركات الفوضوية يبدو الخلوية والتفاعلات داخل الغدد الليمفاوية يؤدي إلى استجابة مناعية فعالة. ويتم استعراض شامل هذا التقدم في منشور صدر مؤخرا 1 ، الذي يسرد ما يزيد على 100 ورقات واصفا طلب من اثنين من الفوتون المجهري للimmunoimaging.
Acknowledgments
نود أن نشكر ريبيكا باكيت للمساعدة في تحضير كاشف. معتمد من قبل MPM زمالة روث Kirchstein L. predoctoral من المعاهد الوطنية للصحة ودعم من المنح GM - 41514 (MDC) ، NS - 48252 (KGC) ، GM - 48071 (IP) أيضا من المعاهد الوطنية للصحة.
References
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
