Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Summary

Deux photons d'imagerie a permis de découvrir la motilité des lymphocytes et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et pendant une réponse immunitaire ^1. Ici, nous démontrons le transfert adoptif de lymphocytes T, l'isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans les ganglions lymphatiques retirés.

Abstract

Deux photons d'imagerie a révélé une chorégraphie élégante de la motilité et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et à l'initiation d'une réponse immunitaire ^1. Ici, nous présentons les méthodes pour le transfert adoptif de cellules T étiqueté, l'isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans le ganglion lymphatique explantés que décrite pour la première en 2002 ^2. L'imagerie à deux photons de cellules immunitaires nécessite que les cellules sont marquées par fluorescence, soit par coloration avec un colorant Tracker cellulaire ou en exprimant une protéine fluorescente. Nous démontrons la procédure de transfert adoptif de cellules dérivées de l'injection de souris donneuses dans la veine caudale d'un animal receveur, où ils abritent les organes lymphoïdes dans environ 15-30 min. Nous illustrons l'isolement d'un ganglion lymphatique et de décrire des méthodes pour assurer une fixation correcte du ganglion excisé. D'autres considérations telles que l'oxygénation correcte des médias perfusé, la température et la puissance du laser sont discutées. Enfin, nous présentons des images vidéo en 3D de cellules CD4 + naïves T présentant motilité état stationnaire à 37 ° C.

Protocol

1. Le transfert adoptif de cellules:

Veine de la queue ou par injection intra-oculaire sont à la fois des méthodes appropriées pour l'introduction de cellules tracker-étiquetés ou exprimant la protéine fluorescente-lymphocytes. Dans cette vidéo. nous démontrons transfert adoptif de cellules par injection dans la veine de la queue.

a. Matériaux

Lymphocytes T CD4 + sont étiquetés avec 1,4 uM CFSE pendant 30 minutes à 37 º C, lavées deux fois, et re-suspendues dans 100 ul de RPMI-1640. Les cellules sont chargées dans une solution stérile de calibre 28 seringue à insuline pour l'injection. Le nombre de cellules utilisées dépend de l'expérience en cours. Généralement, 5 millions de cellules T sont suffisants pour la visualisation des cellules T simples. Un dispositif de retenue des rongeurs pour la souris est nécessaire pour prévenir les blessures à l'animal et à vous-même.

b. Sécurisation de l'animal

La souris est sécurisé pour le transfert adoptif par lentement soutien de l'animal dans le dispositif de retenue des rongeurs (voir vidéo) et la fermeture à la fin ouverte du tube en appuyant délicatement sur le piston. Ne pas laisser aller de la queue de la souris lors de ce processus, comme certains petits animaux peuvent tourner autour à l'intérieur du dispositif de retenue. Cette méthode empêche l'animal de se blesser et de se déplacer pendant l'injection. Lorsque la mise en place du dispositif de retenue des rongeurs, ne pas pousser le piston dans plus que nécessaire pour garder l'animal de sauter vers l'avant. Aussi, ne pas pousser le piston contre l'animal, et ne pas laisser l'animal dans le dispositif de retenue pour une période de temps prolongée.

C. Visualiser le veine de la queue

Tirez doucement la queue vers vous afin qu'il soit légèrement enroulée sur votre index et maintenu contre l'intérieur du doigt par votre pouce. Identifier les veines caudales situées de chaque côté de la queue verticale. La visualisation est facilitée par le réchauffement de la queue à l'eau tiède, puis essuyer avec de l'éthanol.

d. L'injection de cellules

Lorsque la veine a été localisé, insérez la seringue en biseau vers le haut à un angle parallèle à la veine superficielle. Une fois dans la veine, doucement appuyer sur le piston, si vous êtes dans la veine il devrait y avoir aucune résistance à l'injection. S'il ya une résistance, retirez la seringue et essayez de nouveau dans un endroit différent.

Si vous êtes dans la veine, lentement appuyer sur le piston jusqu'à ce que l'injection est terminée. La queue ne doit pas devenir distendu pendant l'injection. Si c'est le cas, cela voudrait dire que l'aiguille n'est pas dans la veine. Il est possible de «perdre» la veine lors de l'injection. Si cela se produit, retirez l'aiguille et essayez votre injection à un endroit différent. Si vous avez besoin d'essayer plus d'une injection, il est préférable de déplacer la queue vers le corps de la souris à partir du site d'injection d'origine. Planifiez à l'avance de cette possibilité en commençant distalement sur la queue pour vous donner la place pour une autre tentative de transfert adoptif.

e. Post-injection considérations

Après l'injection est terminée, un petit reflux du sang de la veine va se produire. Appuyez doucement sur le site d'injection avec un nettoyage essuyez jusqu'à ce que le saignement cesse. Retirer le piston et laissez l'animal marche en avant, hors de la de contention, tout doucement en tenant la queue.

Toujours vérifier auprès de votre comité de protection des animaux et des protocoles d'utilisation d'animaux pour vous assurer de la conformité. Il est important de pratiquer cette technique plusieurs fois avant de tenter l'expérience réelle.

2. Isolement des ganglions lymphatiques

Isolement des ganglions lymphatiques pour deux d'imagerie photonique exige l'élimination soigneuse du ganglion correcte du tissu environnant.

a. Sélection et localisation des ganglions lymphatiques périphériques

Sélection des ganglions lymphatiques pour l'imagerie dépendra des objectifs expérimentaux. Soyez conscient de l'infection locale ou par injection ganglions lymphatiques, et sélectionnez le nœud approprié pour l'imagerie. L'article de Van den Broeck et al., Décrit l'emplacement et la morphologie des ganglions lymphatiques murins en détail ^3. Dans cette vidéo, nous démontrons l'excision des six grandes ganglions lymphatiques périphériques qui sont appropriées pour l'isolement cellulaire ou d'imagerie.

b. Ablation des ganglions lymphatiques:

Gardez à l'esprit de l'intégrité des tissus tout en retirant les ganglions lymphatiques. Attention à ne pas rompre la capsule ou dans tout autre manière d'endommager la structure des ganglions lymphatiques. La perte d'intégrité structurale des ganglions lymphatiques de compromettre l'expérience. Si nécessaire, retirez la graisse de la surface des ganglions lymphatiques avec de fines pinces à disséquer (# 5 Dumont), sous un microscope à dissection. Les ganglions lymphatiques ne devrait pas avoir de graisse restant sur la surface du noeud, car cela va obscurcir l'imagerie par diffusion de la lumière.

Une bonne excision des ganglions lymphatiques est aussi une technique importante à la pratique avant la première expérience réelle.

3. Nod lymphatiquese Imaging configuration et considérations

Le ganglion lymphatique doit être fixé au stade de l'imagerie, qui dans ce cas constitué d'une chambre de retrait. Réchauffé, oxygène perfusé médias est pompé dans la chambre d'un côté à l'aide d'une pompe péristaltique et radiateur en ligne, et il sort par un canal vers le bas classés dans une chambre de collecte avec un tube à vide dans un ballon à la collecte des déchets. Dans notre système, le ganglion lymphatique est immergé dans 37 ° C des médias et de super-perfusés avec qualité médicale carbogène (5% de CO _2, 95% d'O _2). La température du support de perfusion doivent être enregistrées au plus près des ganglions lymphatiques que possible. Votre système particulier peut exiger des variations dans le débit des médias et de la scénographie pour accueillir la platine du microscope et objective.

a. Configuration lymphatiques imagerie noeud:

Comme le montre la vidéo, nous avons sécurisé les ganglions lymphatiques en commençant par l'attacher, médullaires vers le bas (à l'image de T ou des zones de cellules B en utilisant un microscope droit) pour une lamelle en plastique, coupées à la taille appropriée. Il est important d'utiliser une colle tissulaire non toxique (que nous utilisons Vetbond ™ de 3M Corporation).

La lamelle est garanti dans les médias qui coule en plaçant une mince couche de graisse silicone sur la face inférieure de la lamelle, puis adhère à la base de ce verre de la chambre de l'imagerie.

b. 2-Photon considérations d'imagerie:

Plusieurs facteurs peuvent causer des lymphocytes à arrêter de bouger: la température est trop élevée ou trop basse; excès de puissance du laser, la compression ou d'autres dommages à des ganglions lymphatiques et le manque d'oxygène. Les dommages dus à la puissance du laser excessive ou à des températures> ~ 39 ° C est irréversible.

Si les cellules sont faibles, il est souvent préférable d'augmenter le gain du détecteur ou le protocole de cellules-étiquetage plutôt que d'utiliser une puissance supérieure au laser pour visualiser les cellules. Optimisation de l'étiquetage ou l'expression de protéines fluorescentes peut être nécessaire d'apporter de la fluorescence au-dessus du niveau de l'autofluorescence de fond. Avec un gain raisonnable et des réglages de puissance laser, sur un décalage de deux journaux de la fluorescence-dessus de référence (mesuré par cytométrie en flux) est raisonnable pour la visualisation des cellules.

Avec accordable à deux photons des lasers, la longueur d'onde utilisée pour l'excitation devrait être un peu moins que le double du maximum d'excitation monophotonique du fluorophore étant imagé. En deux photons expériences en utilisant plus d'une étiquette ou d'une protéine fluorescente, il peut être nécessaire d'expérimenter avec la longueur d'onde d'excitation utilisée pour trouver les réglages optimaux pour les deux labels. D'excitation à deux photons peuvent aussi être utilisés pour des structures d'image collagène endogène en prenant avantage de la valeur intrinsèque de génération de second harmonique bleue. Deuxième génération d'harmoniques (SHG) se produit lorsque deux photons sont combinés au sein d'un matériau et émettent un photon unique de deux fois la fréquence des photons d'origine. Dans les tissus, excitation à deux photons se produit lorsque la lumière laser incidente est perpendiculaire à une structure de protéine hautement ordonnés tels que le collagène.

Questions pratiques concernant l'imagerie à deux photons ont été discutés en ⁴ critiques ^{aperçu, 5.}

Discussion

Dans ce protocole vidéo, nous montrons les procédures de transfert de cellules adoptifs et l'isolement des ganglions lymphatiques et la préparation nécessaire pour la motilité des lymphocytes imagerie dans un ganglion lymphatique périphérique. Deux photons d'imagerie a plusieurs avantages sur l'imagerie confocale dans les deux tissus explantés (illustré ici) et dans les préparations intravitale. Notamment, l'utilisation des infra-rouge d'excitation minimise diffusion de la lumière et permet à l'imagerie ~ 300 micromètres dessous de la capsule du ganglion lymphatique et plus profondes dans certains tissus ^4. Par ailleurs, multi-photons d'excitation est limitée au point focal de l'objectif, en minimisant photoblanchiment et les lésions tissulaires à côté du plan focal. Comme avec toute nouvelle technique, cependant, à deux photons d'imagerie n'est pas une panacée et ses limites et ses pièges potentiels doivent garder à l'esprit ^5. Parmi eux se trouve l'exigence que - sauf signaux intrinsèques telles que seconde génération de l'harmonique par le collagène des cellules d'intérêt doivent être marqués par fluorescence par des sondes extrinsèques ou par expression de protéines fluorescentes. L'impression est donc créé que ces cellules marquées sont la natation dans un vide noir, tandis que dans la vérité, ils sont immergés dans, et d'interagir avec un environnement complexe d'éléments structurels et une myriade d'autres non étiquetés, les cellules invisibles.

Au cours des six années écoulées depuis l'introduction de deux photons d'imagerie pour l'immunologie, cette technique a permis aux chercheurs d'examiner des questions de longue date par les visualisant directement dans les tissus vivants intacts processus, y compris interactions cellule-cellule, la motilité cellulaire et la localisation, voies de signalisation cellulaire et les cellules cytotoxiques tuant des événements. Le champ a évolué rapidement au-delà des premières descriptions phénoménologiques, et des analyses quantitatives avec modélisation et simulation informatiques commencent maintenant à faire comprendre comment les mouvements apparemment chaotique cellulaire et les interactions au sein des ganglions lymphatiques conduire à une réponse immunitaire efficace. Ce progrès est examiné en détail dans une publication récente ^1, qui recense plus de 100 documents décrivant l'application de la microscopie à deux photons pour immunoimaging.