Summary
दो photon इमेजिंग बेसल शर्तों के तहत लसीका नोड के भीतर और एक प्रतिरक्षा 1 प्रतिक्रिया के दौरान लिम्फोसाइट गतिशीलता और सेलुलर बातचीत पर्दाफाश किया है. यहाँ, हम टी कोशिकाओं, लिम्फ नोड्स के अलगाव, इमेजिंग और सीडी 4 की गतिशीलता + explanted लिम्फ नोड में टी कोशिकाओं की दत्तक हस्तांतरण प्रदर्शित करता है.
Abstract
दो photon इमेजिंग बेसल शर्तों के तहत लसीका नोड के भीतर और एक एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा गतिशीलता और सेलुलर बातचीत के एक सुरुचिपूर्ण नृत्यकला से पता चला है . यहाँ, हम लेबल टी कोशिकाओं, लिम्फ नोड्स के अलगाव, इमेजिंग और सीडी 4 की गतिशीलता + explanted लसीका नोड के रूप में पहली बार 2 2002 में वर्णित में टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के दो photon इमेजिंग की आवश्यकता है कि कोशिकाओं fluorescently लेबल रहे हैं या तो एक सेल tracker डाई के साथ धुंधला हो जाना या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की. हम कोशिकाओं को इंजेक्शन के दत्तक हस्तांतरण प्रक्रिया में दाता चूहों से ली गई एक प्राप्तकर्ता जानवर की पूंछ नस, जहां वे लगभग 15-30 मिनट के भीतर lymphoid अंगों को घर. प्रदर्शित हम एक लसीका नोड के अलगाव को वर्णन और विधियों का वर्णन करने के लिए excised लिम्फ नोड के उचित बढ़ते सुनिश्चित. Perfused मीडिया, तापमान, और लेसर शक्ति के समुचित oxygenation जैसे अन्य कारणों पर विचार - विमर्श कर रहे हैं. अंत में, हम भोले CD4 के 3D वीडियो छवियों + टी कोशिकाओं 37 पर स्थिर राज्य गतिशीलता प्रदर्शन मौजूद डिग्री सेल्सियस
Protocol
1. कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण:
पूंछ नस या intraocular इंजेक्शन ट्रैकर लेबल या फ्लोरोसेंट लिम्फोसाइटों सेल प्रोटीन व्यक्त की शुरूआत के लिए दोनों उपयुक्त तरीके हैं. इस वीडियो में. हम पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण प्रदर्शित करता है.
ए माल
सीडी 4 + टी कोशिकाओं 37 º सी में 30 मिनट के लिए 1.4 सुक्ष्ममापी CFSE के साथ चिह्नित कर रहे हैं, दो बार धोया, और फिर RPMI - 1640 की 100 μL में निलंबित कर दिया. कक्ष एक बाँझ इंजेक्शन के लिए 28 गेज इंसुलिन सिरिंज में लोड कर रहे हैं. इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या में प्रयोग किया जा रहा है पर निर्भर करता है है. आमतौर पर, 5 लाख टी कोशिकाओं सरल टी सेल दृश्य के लिए पर्याप्त हैं. माउस के लिए एक कृंतक restrainer जानवर के लिए और अपने आप को चोट को रोकने की जरूरत है.
ज. जानवर सुरक्षित
माउस दत्तक हस्तांतरण के लिए धीरे धीरे कृंतक restrainer में पशु समर्थन (वीडियो देखें) और धीरे सवार निराशाजनक द्वारा ट्यूब के खुले अंत के बंद के द्वारा सुरक्षित है. माउस पूंछ के चलते इस प्रक्रिया के दौरान, के रूप में कुछ छोटे जानवरों के आसपास restrainer अंदर चालू कर सकते हैं मत करो. इस पद्धति का ही घायल और इंजेक्शन के दौरान बढ़ने से जानवरों को रोकता है. जब कृंतक restrainer की स्थापना, आगे में सवार से आगे कूद से पशु रखने के लिए आवश्यक है धक्का नहीं है. इसके अलावा, पशु खिलाफ सवार धक्का नहीं है और समय की एक विस्तारित अवधि के लिए जानवर नहीं छोड़ restrainer में.
सी. पूंछ नस visualizing
धीरे आप की ओर पूंछ ताकि इसे हल्के ढंग से अपने सूचकांक उंगली पर लपेटा जाता है और अपने अंगूठे से उंगली के अंदर के खिलाफ आयोजित खींच. पूंछ ईमानदार पूंछ के दोनों तरफ स्थित नसों को पहचानें. विज़ुअलाइज़ेशन गर्म पानी के साथ पूंछ वार्मिंग, तो इथेनॉल के साथ नीचे पोंछते द्वारा सुविधा है.
मृ कोशिकाओं इंजेक्शन
जब नस स्थित किया गया है, एक उथले कोण नस के समानांतर में सिरिंज बेवल साइड सम्मिलित. नस में एक बार, सवार धीरे दबाना, अगर तुम नस में हैं इंजेक्शन के लिए कोई विरोध नहीं होना चाहिए. अगर वहाँ किसी भी प्रतिरोध है, सिरिंज को हटाने और एक अलग स्थान में फिर से कोशिश करें.
यदि आप नस में हैं, सवार धीरे दबाना जब तक इंजेक्शन पूरा हो गया है. पूंछ इंजेक्शन के दौरान distended नहीं बनना चाहिए. अगर यह होता है, इसका मतलब यह होगा कि सुई नस में नहीं है. इंजेक्शन के दौरान नस "खो" यह संभव है. यदि ऐसा होता है, सुई को हटाने और एक अलग जगह में अपने इंजेक्शन की कोशिश. यदि आप एक से अधिक इंजेक्शन का प्रयास करने की आवश्यकता है, यह सबसे अच्छा है पूंछ मूल इंजेक्शन साइट से माउस के शरीर की ओर कदम. इस संभावना के लिए आगे योजना पूँछ पर distally शुरू करने के लिए अपने दत्तक हस्तांतरण पर एक और प्रयास के लिए कमरा दे.
ई. पोस्ट - इंजेक्शन विचार
इंजेक्शन के बाद पूरा हो गया है, एक छोटे से नस से खून की पीठ प्रवाह हो जाएगा. धीरे से खून बह रहा बंद हो जाता है जब तक साफ - पोंछ के साथ इंजेक्शन साइट दबाएँ. सवार निकालें और जानवर आगे चलना, restrainer से बाहर है, जबकि धीरे पूंछ पर पकड़े.
हमेशा अपने जानवरों की देखभाल समिति और जानवरों के उपयोग प्रोटोकॉल के साथ जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप अनुपालन में हैं. यह महत्वपूर्ण है इस तकनीक का वास्तविक प्रयोग की कोशिश कर रहा से पहले कई बार अभ्यास.
2. लसीका नोड अलगाव
दो photon इमेजिंग के लिए लिम्फ नोड्स के अलगाव सही लिम्फ नोड के आसपास के ऊतकों से सावधान हटाने की आवश्यकता है.
ए परिधीय लिम्फ नोड्स के चयन और स्थान
इमेजिंग के लिए लिम्फ नोड्स का चयन प्रयोगात्मक लक्ष्यों पर निर्भर करेगा. स्थानीय संक्रमण या इंजेक्शन से draining लिम्फ नोड्स के बारे में पता है, और इमेजिंग के लिए उपयुक्त नोड का चयन करें. वान डेन Broeck एट अल द्वारा लेख, स्थान और 3 में विस्तार से murine लिम्फ नोड्स की आकारिकी का वर्णन करता है. इस वीडियो में, हम छह बड़े परिधीय लिम्फ नोड्स जो सेल अलगाव या इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं की छांटना प्रदर्शित करता है.
ज. लसीका नोड को हटाने:
जबकि लिम्फ नोड्स को हटाने के मन में ऊतक की अखंडता रखें. कैप्सूल टूटना या किसी भी तरह से नुकसान में लिम्फ नोड संरचना नहीं सावधान रहो. लसीका नोड संरचनात्मक अखंडता की हानि प्रयोग समझौता नहीं करेंगे. यदि आवश्यक हो, एक विदारक खुर्दबीन के नीचे ठीक संदंश विदारक (# 5 Dumont) के साथ लसीका नोड सतह से चर्बी हटाने. लिम्फ नोड्स नोड की सतह पर किसी भी शेष वसा नहीं है, के रूप में यह प्रकाश बिखरने इमेजिंग अस्पष्ट जाएगा चाहिए.
लिम्फ नोड्स के समुचित छांटना भी पहली वास्तविक प्रयोग से पहले अभ्यास के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है.
3. लसीका इशाराई इमेजिंग सेटअप और विचारणीय बातें
लिम्फ नोड इमेजिंग मंच है, जो इस मामले में एक recessed चैम्बर के होते हैं करने के लिए सुरक्षित किया जाना चाहिए. वार्म, ऑक्सीजन perfused मीडिया एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और इनलाइन हीटर का उपयोग कर एक तरफ से कक्ष में पंप है, और यह बर्बादी संग्रह फ्लास्क के लिए एक वैक्यूम ट्यूब के साथ एक नीचे वर्गीकृत एकत्रित चेंबर में चैनल के माध्यम से बाहर निकलता है. हमारी प्रणाली में, लसीका नोड 37 में डूबे हुए है डिग्री सेल्सियस मीडिया और चिकित्सा ग्रेड carbogen (5% सीओ 2, 95% 2 हे) के साथ सुपर perfused . छिड़काव मीडिया के तापमान लिम्फ नोड के करीब के रूप में दर्ज किया जाना चाहिए के रूप में संभव है. अपने खास सिस्टम मीडिया प्रवाह दर और मंच डिजाइन में बदलाव खुर्दबीन मंच और उद्देश्य को समायोजित करने के लिए आवश्यकता हो सकती है.
ए लसीका नोड इमेजिंग स्थापना:
वीडियो में दिखाया गया है, हम पहली बार इसे संलग्न द्वारा लिम्फ नोड सुरक्षित, नीचे दिमाग़ी ओर एक प्लास्टिक coverslip, उपयुक्त आकार कटौती करने के लिए (छवि टी या बी सेल एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग क्षेत्रों). यह एक ऊतक गैर विषैले गोंद (हम 3M निगम से VetBond ™ का उपयोग करें) का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
coverslip बह मीडिया में कवर पर्ची के underside पर सिलिकॉन तेल की एक छोटी थपका रखकर सुरक्षित है, तो इमेजिंग चैम्बर के गिलास के आधार पर इस पालन.
ज. 2 फोटॉन इमेजिंग विचार:
कई कारकों लिम्फोसाइटों चलती रोकने के लिए पैदा कर सकता है है: तापमान है कि बहुत अधिक या बहुत कम है, अधिक लेसर शक्ति, संपीड़न या लिम्फ नोड के लिए अन्य नुकसान, और ऑक्सीजन की कमी है. अत्यधिक लेसर शक्ति या तापमान की वजह से नुकसान की> 39 ~ डिग्री सेल्सियस अपरिवर्तनीय है.
यदि कोशिकाओं को मंद कर रहे हैं, यह आम तौर पर बेहतर है डिटेक्टर या एक उच्च शक्ति लेजर का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को कल्पना के बजाय प्रोटोकॉल सेल - लेबलिंग लाभ में वृद्धि. लेबलिंग या फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अनुकूलन करने के लिए पृष्ठभूमि autofluorescence के स्तर से ऊपर प्रतिदीप्ति लाने के लिए आवश्यक हो सकता है. उचित लाभ और आधारभूत ऊपर दो लॉग प्रतिदीप्ति के बदलाव के बारे में लेसर शक्ति सेटिंग्स, के साथ (प्रवाह cytometry द्वारा मापा) सेल दृश्य के लिए उचित है.
Tunable दो photon लेज़रों के साथ, उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया तरंगदैर्ध्य डबल एकल फोटॉन जा रहा है imaged की fluorophore उत्तेजना अधिकतम की तुलना में थोड़ा कम किया जाना चाहिए. दो photon एक से अधिक लेबल या फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर प्रयोगों में यह उत्तेजना दोनों लेबल के लिए इष्टतम सेटिंग्स खोजने के लिए इस्तेमाल तरंग दैर्ध्य के साथ प्रयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. दो photon उत्तेजना भी आंतरिक नीले दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी का लाभ लेने के द्वारा छवि अंतर्जात कोलेजन संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) जहां दो photons एक सामग्री के भीतर संयुक्त कर रहे हैं होता है और दो बार मूल फोटॉनों की आवृत्ति की एक फोटान फेंकना. ऊतक में, दो photon उत्तेजना होती है जब घटना लेजर प्रकाश एक अत्यधिक आदेश दिया कोलेजन जैसे प्रोटीन संरचना को सीधा है.
दो photon इमेजिंग के बारे में व्यावहारिक मुद्दों पूर्वावलोकन 4 समीक्षाएँ, 5 में विचार - विमर्श किया गया.
Discussion
इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम दत्तक सेल हस्तांतरण और लसीका नोड अलगाव और इमेजिंग एक परिधीय लसीका नोड में लिम्फोसाइट गतिशीलता के लिए आवश्यक तैयारी के लिए प्रक्रियाओं दिखा. दो photon इमेजिंग दोनों explanted ऊतकों (यहाँ दिखाया गया है) में और intravital तैयारी में confocal इमेजिंग पर कई फायदे हैं. विशेष रूप से, इन्फ़रा लाल उत्तेजना का उपयोग प्रकाश बिखरने minimizes और लिम्फ नोड के कैप्सूल नीचे ~ इमेजिंग 300 micrometers के लिए अनुमति देता है और कुछ 4 ऊतकों में गहरे. इसके अलावा, बहु photon उत्तेजना उद्देश्य के केन्द्र बिन्दु के लिए प्रतिबंधित है, विरंजन फ़ोटो और फोकल हवाई जहाज़ की ओर बाहर ऊतकों को नुकसान कम से कम. किसी भी नई तकनीक के साथ के रूप में, तथापि, दो photon इमेजिंग एक रामबाण नहीं है अपनी सीमाओं और संभावित नुकसान के 5 दिमाग में रखा जाना चाहिए. कोलेजन ब्याज की कोशिकाओं द्वारा दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी के रूप में में आंतरिक संकेतों को छोड़कर fluorescently बाह्य जांच या फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा लेबल होना चाहिए कि इनमें आवश्यकता है. छाप इस तरह बनाया है कि इन कोशिकाओं लेबल को एक काले शून्य में तैर रहे हैं, जबकि सच में वे डूब रहे हैं, और संरचनात्मक तत्वों और असंख्य अन्य unlabeled, अदृश्य कोशिकाओं की एक जटिल पर्यावरण के साथ बातचीत.
दो photon इमेजिंग के इम्यूनोलॉजी शुरूआत के बाद से छह वर्षों में, इस तकनीक शोधकर्ताओं की अनुमति दी गई है बरकरार रहने वाले सेल सेल बातचीत, सेल गतिशीलता और स्थानीयकरण, सेलुलर संकेत दे रास्ते और साइटोटोक्सिक सेल सहित ऊतकों प्रक्रियाओं में सीधे visualizing द्वारा लंबे समय से सवालों के पते घटनाओं की हत्या. क्षेत्र तेजी से प्रारंभिक phenomenological वर्णन से परे विकसित किया गया है, और मात्रात्मक विश्लेषण कंप्यूटर मॉडलिंग और सिमुलेशन के साथ साथ अब कैसे जाहिरा तौर पर अराजक सेलुलर गतियों और बातचीत के लिम्फ नोड्स के भीतर एक कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए नेतृत्व की भावना बनाने की शुरुआत कर रहे हैं. एक हाल ही में एक प्रकाशन, जो 100 immunoimaging के लिए दो photon माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन अधिक पत्र को सूची बद्ध करता है में इस प्रगति को व्यापक समीक्षा की है.
Acknowledgments
हम रेबेका Paquette अभिकर्मक तैयारी के साथ सहायता के लिए धन्यवाद. एम पी एम रुथ स्वास्थ्य और जीएम - 41,514 अनुदान (एमडीसी), एन एस 48,252 (KGC), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से भी जीएम 48,071 (आईपी) से समर्थन के राष्ट्रीय संस्थानों से एल Kirchstein predoctoral फेलोशिप द्वारा समर्थित है.
References
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