Summary
두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.
Abstract
두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 1의 개시에 운동성 및 세포 상호 작용의 우아한 안무를 밝혔다. 여기, 우리는 표시된 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + 첫번째 2002 2에서 설명한대로 explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을위한 방법을 제시한다. 면역 세포의 2 광자 영상은 세포가 찬란 셀 추적기 색소와 얼룩이나 형광 단백질을 표현을 통해, 레이블 것을 요구합니다. 우리는받는 동물의 꼬리 정맥 약 15-30 분 이내에 림프 장기들이 집.에 공여 마우스에서 파생된 주입 세포의 입양 전송 절차를 보여주는 우리는 림프 노드의 절연 설명하고 excised 림프 노드의 적절한 장착을 보장하는 방법을 설명합니다. 이러한 perfused 미디어, 온도 및 레이저 파워의 적절한 산소와 같은 다른 고려 사항은 설명합니다. 마지막으로, 우리는 순진한 CD4의 3D 영상 + T 세포 37 정상 상태 운동성을 전시을 제시 ° C.를
Protocol
1. 세포의 입양 전송 :
꼬리 정맥 또는 intraocular 주사 셀 추적 - 라벨이나 형광 단백질 표현 lymphocytes의 도입에 대해 모두 적합한 방법입니다. 이 비디오에서. 우리는 꼬리 정맥 주입에 의해 세포의 입양 전송을 보여줍니다.
A. 자료
CD4 + T 세포가 37 º C에서 30 분 1.4 μm의의 CFSE으로 표시 들이고, 두 번 씻어 및 RPMI - 1640 100 μL에 다시 정지. 세포 주입을위한 멸균 28 게이지 인슐린 주사기에로드됩니다. 사용하는 세포의 숫자는 실험이 완료되는에 따라 달라집니다. 일반적으로 5 백만 T 세포는 T 세포 간단한 시각화 충분합니다. 마우스 쥐 restrainer은 동물과 자신에게 부상을 방지하기 위해 필요합니다.
B. 동물 확보
마우스는 천천히 (동영상 참조) 쥐 restrainer에 동물을 백업하고 부드럽게 플런저를 우울하여 튜브의 열린 끝을 닫아 입양 전송을위한 보안입니다. 몇 가지 작은 동물이 restrainer 내부 돌아 수 있으므로,이 과정에서 마우스 꼬리 놓지 마십시오. 이 방법은 자신을 상처로부터 주입하는 동안 이동에서 동물을 방지할 수 있습니다. 쥐 restrainer을 설정할 때, 앞으로 점프에서 동물을 유지하는 데 필요한보다 더의 플런저를 밀어하지 않습니다. 또한, 오랜 기간 동안 restrainer에있는 동물을 떠나지 않는 동물에 대한 플런저를 밀어하지 않으며.
C. 꼬리 정맥을 떠올리
부드럽게가 가볍게 당신의 검지 손가락을 통해 싼와 엄지로 손가락 안쪽에 개최되도록 당신을 향해 꼬리를 가져옵니다. 수직 꼬리의 양쪽에있는 꼬리 정맥을 식별합니다. 시각화는 다음 에탄올로 닦고, 따뜻한 물로 꼬리를 온난 화에서 용이합니다.
D. 세포의 분사
정맥이있는되면, 정맥에 얕은 각도 병렬에서 주사기 베벨 쪽을 삽입합니다. 일단 정맥에 부드럽게 플런저를 우울하게, 당신은 정맥에 주사하는 경우에 대해 저항도 없을 것입니다. 어떤 저항이있다면 주사기를 제거하고 다른 위치에 다시 시도하십시오.
당신이 정맥에 주입하는 경우가 완료될 때까지 천천히 플런저를 우울. 꼬리는 사출 동안 팽창이 될 것입니다. 그것이 없으면, 이것은 바늘이 혈관에 있지 않은 것을 의미합니다. 주사하는 동안 정맥를 "분실"하는 것이 가능합니다. 이런 경우에는 바늘을 제거하고 다른 자리에 주사를보십시오. 하나 이상의 주사를 시도해야하는 경우 그것은 원래의 주사 사이트에서 마우스의 몸에 대한 꼬리를 이동하는 것이 좋습니다. 입양 전송에서 또 다른 시도에 대해 자신에게 공간을 제공하기 위해 꼬리에 distally 시작하여이 가능성에 대해 미리 계획을 세우십시오.
E. 포스트 분사 고려
주입이 완료되면 정맥의 혈액의 작은 뒤로 흐름이 발생합니다. 부드럽게 출혈이 멈출 때까지 청소 닦아와 주사 사이트를 누릅니다. 플런저를 제거하고 부드럽게 꼬리로 누른 상태에서 동물이 밖 restrainer의 앞으로 갑시다.
항상 당신이 준수되도록하기 위해 동물 관리위원회 동물 사용 프로토콜에 문의하십시오. 실제 실험을 시도하기 전에이 기술 여러 번 연습하는 것이 중요합니다.
2. 림프절 격리
두 광자 이미징을위한 림프절의 절연은 주변 조직에서 올바른 림프 노드의주의 제거가 필요합니다.
A. 선택과 주변 림프절의 위치
이미징을위한 림프절의 선택은 실험의 목표에 따라 달라집니다. 지역 감염이나 사출 배수 림프절을 인식하고, 영상에 해당하는 노드를 선택합니다. 반 덴 브로크 외 의한 문서., 세부 3 murine 림프절의 위치와 형태에 대해 설명합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세포 격리 또는 영상에 적합 여섯 대형 주변 림프절의 절단을 보여줍니다.
B. 림프절 제거 :
림프절을 제거하는 동안 염두에두고 조직의 무결성을 유지. 하지 파열 캡슐을하거나 어떤 식으로든 손상의 림프절 구조를주의하십시오. 림프절 구조적 무결성의 손실이 실험을 손상됩니다. 필요한 경우, 해부 현미경으로 미세 (# 5 뒤몽) 해부 포셉와 림프절 표면에서 지방을 제거합니다. 임파선이 빛을 산란하여 영상을 흐릿하게하므로, 노드의 표면에 남아있는 지방을 말았 어야지.
림프절의 적절한 절단도 처음으로 실제 실험을하기 전에 연습하는 중요한 기술입니다.
3. 림프 노드E 이미징 설치 및 고려 사항
림프절이 경우에는 recessed 챔버로 구성되어 이미징 단계에 확보해야합니다. 예열 산소 - perfused 미디어가 연동 펌프와 인라인 히터를 사용하여 한쪽에서 챔버에 펌핑하고, 폐기물 수집 플라스크에 진공 튜브와 수집 챔버로 아래쪽 등급 채널을 통해이 종료됩니다. 시스템에서 림프절은 37에 빠져들 수 있습니다 ° C 미디어와 의료 학년 carbogen (5 % CO 2 95 % O 2)와 슈퍼 perfused. 가능한 같은 재관류 미디어의 온도는 림프절에 가까운로 기록되어야합니다. 특정 시스템은 미디어 유량 및 무대 디자인 변화가 현미경의 무대와 목적을 수용해야 할 수도 있습니다.
A. 림프절의 이미지 설정 :
마찬가지로 비디오와 같이, 우리가 처음 그것을 부착하여 림프절을 확보, 적절한 크기로 절단 플라스틱 coverslip, 아래로 골수의 쪽 (이미지 T 또는 수직 현미경을 사용하여 B 세포 지역으로). 무독성 조직 접착제를 (우리는 3M 사의 VetBond ™를 사용)를 사용하는 것이 중요합니다.
coverslip은 다음 이미징 챔버의 유리 기지에 이것을 준수, 커버 슬립의 아래쪽에 실리콘 그리스의 작은 소량을 배치하여 흐르는 매체 확보됩니다.
B. 2 - 광자 이미징 고려 사항 :
여러 가지 요인이 lymphocytes가 이동을 중지시킬 수 있습니다 : 너무 높거나 너무 낮습니다 온도, 과도한 레이저의 파워, 압축 또는 림프절 다른 손상 및 산소 부족합니다. 과도한 레이저 전력이나 온도에 의한 손상> ~ 39 ° C 되돌릴 수 있습니다.
세포가 희미한 경우, 그것은 오히려 세포를 시각화하는 높은 레이저 전원을 사용하여보다 검출기 이득 또는 셀 라벨 프로토콜을 높이기 위해 일반적으로 더 좋습니다. 형광 단백질의 라벨이나 표현의 최적화는 배경 autofluorescence의 수준 위에있는 형광을 제공할 수 필요할 수 있습니다. 기준 이상의 형광의 두 로그의 변화에 대한 합리적인 이득 및 레이저 전원 설정과 함께 (유동세포계측법에 의해 측정) 세포 시각화를위한 합리적이다.
조정할 수있는 두 개의 광자 레이저로 여기에 사용되는 파장은 몇 군데되는 형광단의 더블 단일 광자 여기 최대보다 약간 작아야한다. 하나 이상의 레이블이나 형광 단백질을 사용하여 두 광자 실험에서는 두 레이블에 대한 최적 설정을 찾는 데 사용 여기 파장과 실험해야 할 수도 있습니다. 두 광자 여기는 원리 푸른 초 고조파 생성을 활용하여 이미지 내생 콜라겐 구조하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 고조파 세대 (SHG가) 2 광자가 물질 내에서 결합 어디 발생하고 원래의 광자의 두 주파수의 단일 광자 방출. 조직에서 두 광자 여기는 사고 레이저 빛이 같은 콜라겐과 같은 고도로 주문 단백질 구조 직각 경우에 발생합니다.
두 광자 이미징에 관한 실용적인 문제는 미리 리뷰 4, 5에서 논의되었습니다.
Discussion
이 비디오 프로토콜에서 우리는 입양 세포 전송 및 주변 림프절의 영상 림프구의 운동성에 필요한 림프절 절연 및 준비 절차를 보여줍니다. 두 광자 이미징 모두 explanted 티슈 (여기에 표시) 및 intravital 준비에 공촛점 이미징을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 특히, 빛의 산란을 최소화하고 림프절의 캡슐 아래 영상 ~ 300 micrometers 가능하며 일부 조직 4 깊이 적외선 여진 중 하나를 사용하십시오. 또한, 다중 광자 여기는 표백 사진 및 초점 비행기 측면 밖으로 조직 손상을 최소화, 목적의 초점으로 제한됩니다. 새로운 기술과 마찬가지로, 그러나, 두 광자 영상은 만병 통치약이 아니므로 그 제한과 잠재적인 함정은 마음 5 보관해야합니다. 관심 콜라겐 - 세포와 같은 두 번째 고조파 세대로 본질적인 신호를 제외하면 찬란 외부 프로브 또는 형광 단백질의 표현에 의해 표시되어야합니다 - 이러한 가운데 그 요구 사항입니다. 노출 따라서 이러한 분류 세포가 검은 무효로 수영하는가 생성됩니다, 사실 그들은에 열중하고 있으며, 구조적 요소와 무수한 다른 레이블이 지정되지 않은, 보이지 않는 세포의 복잡한 환경과 상호 작용하는 반면.
면역학에 두 광자 이미징의 도입 이후 6 년 만에,이 기술은 직접 세포 - 세포 상호 작용, 세포 운동성 및 현지화, 세포 신호 전달 경로와 세포 독성 세포를 포함하여 그대로 살아있는 조직 프로세스의 시각화하여 오랜 질문을 해결하기 위해 연구자 수 있습니다 이벤트를 죽이고. 필드는 신속하게 초기 현상 학적 설명을 넘어 진화하고 있으며, 함께 컴퓨터 모델링 및 시뮬레이션과 정량 분석은 지금 림프절 내에 분명히 혼란 세포 움직임과 상호 작용이 효율적인 면역 반응으로 이어질 방법을 이해하기 위해 시작되었습니다. 이 진행은 종합적으로 immunoimaging에 대한 두 광자 현미경의 응용 프로그램을 설명하는 100 종이 넘는리스트 최근 간행물 1에서 검토합니다.
Acknowledgments
우리는 시약의 준비와 지원 레베카 파켓 감사하고 싶습니다. MPM은 건강과 보조금 GM - 41514 (MDC), NS - 48252 (KGC), 또한 국립 보건원에서 GM - 48071 (IP)의 지원 국립 연구소에서 루스 L. Kirchstein predoctoral 친교에 의해 지원됩니다.
References
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
