La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Summary

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune ^1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

Abstract

De dos fotones de imágenes ha revelado una coreografía elegante de la motilidad y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y en el inicio de una respuesta inmune ^1. En este sentido, los actuales métodos para la transferencia adoptiva de células T etiquetados, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados como describió por primera vez en 2002 ^2. Imágenes de dos fotones de las células inmunes requiere que las células están marcados con fluorescencia, ya sea mediante la tinción con un colorante de la célula de seguimiento o por expresar una proteína fluorescente. Demostramos el procedimiento de transferencia adoptiva de células derivadas de ratones inyección de donantes en la vena de la cola de un animal receptor, donde el hogar de los órganos linfoides en aproximadamente 15-30 min. Se ilustra el aislamiento de un ganglio linfático y se describen los métodos para asegurar el montaje correcto de los ganglios linfáticos extirpados. Otras consideraciones, como la oxigenación adecuada de los medios de perfusión, la temperatura y la potencia del láser se discuten. Finalmente, se presentan las imágenes de vídeo en 3D de las células CD4 + células T ingenuas exhibiendo la motilidad estado de equilibrio a 37 ° C.

Protocol

1. La transferencia adoptiva de células:

Vena de la cola o la inyección intraocular son métodos adecuados para la introducción de la célula de seguimiento con etiqueta fluorescente o que expresa la proteína de los linfocitos. En este vídeo. hemos demostrado la transferencia adoptiva de células por inyección vena de la cola.

a. Materiales

Células T CD4 + están marcadas con CFSE M 1,4 durante 30 minutos a 37 º C, se lavaron dos veces, y volvió a suspender en 100 L de RPMI-1640. Las células se cargan en una jeringa de insulina estéril calibre 28 para inyección. El número de células utilizadas depende del experimento se está realizando. Por lo general, 5 millones de células T son suficientes para una visualización sencilla de células T. Un limitador de roedores para el ratón es necesario para evitar lesiones en el animal y para ti mismo.

b. Asegurar que el animal

El ratón es seguro para la transferencia adoptiva de respaldo lentamente al animal en la inmovilización de los roedores (ver video) y cerrar el extremo abierto del tubo suavemente el émbolo. ¡No te sueltes de la cola del ratón durante este proceso, ya que algunos animales más pequeños pueden dar la vuelta dentro de la inmovilización. Este método evita que el animal se dañe a sí mismo y que se mueva durante la inyección. Al configurar el limitador de roedores, no empujar el émbolo más allá de lo necesario para mantener los animales de saltar hacia adelante. Además, no empujar el émbolo contra el animal, y no dejar al animal en el que lo detiene por un período prolongado de tiempo.

c. Visualización de la vena de la cola

Tire suavemente de la cola hacia usted para que sea ligeramente envuelta en su dedo índice y se mantiene en la parte interna de los dedos por el pulgar. Identificar las venas de la cola se encuentra en ambos lados de la cola en posición vertical. La visualización es facilitado por el calentamiento de la cola con agua tibia, luego lavarlo con etanol.

d. La inyección de células

Cuando la vena ha sido localizado, inserte la jeringa bisel hacia arriba en un ángulo paralelo a la vena superficial. Una vez en la vena, con suavidad el émbolo, si usted está en la vena no debe haber resistencia a la inyección. Si hay alguna resistencia, retire la jeringa y vuelva a intentarlo en un lugar diferente.

Si usted está en la vena, presione lentamente el émbolo hasta que la inyección se ha completado. La cola no debe dilatarse durante la inyección. Si es así, esto significaría que la aguja no está en la vena. Es posible "perder" la vena durante la inyección. Si esto sucede, retire la aguja e intentar la inyección en un lugar diferente. Si usted necesita para tratar más de una inyección, lo mejor es mover la cola hacia el cuerpo del ratón desde el sitio de la inyección original. Planee con anticipación para esta posibilidad, a partir distal de la cola que tiene el espacio para otro intento en la transferencia adoptiva.

e. Después de la inyección consideraciones

Después de la inyección se ha completado, un pequeño reflujo de la sangre de la vena se producirá. Presione suavemente el sitio de la inyección con una limpieza de limpiar hasta que el sangrado se detenga. Retire el émbolo y dejar que el animal camina hacia adelante, fuera de la inmovilización, mientras que suavemente aferrarse a la cola.

Siempre consulte con su comité de cuidado de los animales y los protocolos de utilización de animales para asegurarse de que están de acuerdo. Es importante practicar esta técnica varias veces antes de intentar el experimento real.

2. El aislamiento del nodo linfático

El aislamiento de los ganglios linfáticos de dos fotones de imágenes requiere la eliminación cuidadosa de los ganglios linfáticos correcta de los tejidos circundantes.

a. Selección y ubicación de los ganglios linfáticos periféricos

Selección de los ganglios linfáticos de imágenes dependerá de los objetivos experimentales. Sea consciente de infección local o por inyección ganglios linfáticos de drenaje, y seleccione el nodo apropiado para la imagen. El artículo de Van den Broeck et al., Describe la ubicación y la morfología de los nódulos linfáticos murino en detalle ^3. En este video, se demuestra la escisión de los seis nodos linfáticos grandes periféricos que son adecuados para el aislamiento de células o de imagen.

b. Extirpación de los ganglios linfáticos:

Tenga en cuenta la integridad de los tejidos, mientras que la eliminación de los ganglios linfáticos. Tenga cuidado de no romper la cápsula o de cualquier forma puedan dañar la estructura de los ganglios linfáticos. Pérdida de la integridad estructural de los ganglios linfáticos pondrá en peligro el experimento. Si es necesario, eliminar la grasa de la superficie de los ganglios linfáticos con finas pinzas de disección (# 5 Dumont) bajo un microscopio de disección. Los ganglios linfáticos no debe tener nada de grasa que queda en la superficie del nodo, ya que esto oscura imagen por la dispersión de la luz.

La extirpación de los ganglios linfáticos adecuada es también una técnica importante para la práctica antes de que el experimento real en primer lugar.

3. Linfáticos Node imágenes de la instalación y consideraciones

El ganglio linfático debe ser asegurado a la etapa de formación de imágenes, que en este caso consiste en una cámara empotrada. Calentado, el oxígeno-perfusión medios de comunicación se bombea a la cámara de un lado mediante una bomba peristáltica y el calentador de línea, y que sale a través de un canal a la baja-clasificados en una cámara de recolección con un tubo de vacío en un matraz de recogida de residuos. En nuestro sistema, el ganglio linfático se sumerge en 37 ° C y los medios de comunicación super-perfundidos con médicos carbogen grado (5% _CO2, 95% O _2). La temperatura de los medios de perfusión debe registrarse como cerca de los ganglios linfáticos de lo posible. Su sistema en particular puede requerir variaciones en el caudal de los medios de comunicación y el diseño del escenario para dar cabida a la platina del microscopio y el objetivo.

a. Los ganglios linfáticos de imagen de configuración:

Como se muestra en el video, seguro que el ganglio linfático por primera fijación, medular hacia abajo (a la imagen de T o de las zonas de células B con un microscopio vertical) a un cubreobjetos de plástico, cortado al tamaño adecuado. Es importante usar un adhesivo tisular no tóxico (se utiliza VetBond ™ de 3M Corporation).

El cubreobjetos se asegura en los medios de comunicación que fluye por la colocación de una cantidad muy pequeña de grasa de silicona en la parte inferior de la hoja de la cubierta, y luego adherirse a esta la base de cristal de la cámara de imágenes.

b. 2-Photon imágenes consideraciones:

Varios factores pueden causar que los linfocitos a dejar de moverse: la temperatura es demasiado alta o demasiado baja, el exceso de potencia del láser, la compresión u otros daños a los ganglios linfáticos, y la falta de oxígeno. Daños debidos a la potencia del láser excesiva o temperaturas> ~ 39 ° C es irreversible.

Si las células son escasas, a menudo es mejor para aumentar la ganancia del detector o el protocolo de células etiquetado en lugar de utilizar un láser de potencia superior para visualizar las células. Optimización de etiquetado o la expresión de proteínas fluorescentes puede ser necesaria para que la fluorescencia por encima del nivel de la autofluorescencia de fondo. Con una ganancia razonable y los ajustes de la potencia del láser, un cambio de dos registros de la fluorescencia por encima del valor (medido por citometría de flujo) es razonable para la visualización de la célula.

Con ajustable de dos fotones láser, la longitud de onda de excitación debe ser un poco menos del doble del máximo de excitación de un solo fotón del fluoróforo se va a examinar. En dos fotones experimentos con más de una etiqueta o proteína fluorescente puede ser necesario experimentar con la longitud de onda de excitación utilizada para encontrar los ajustes óptimos para ambas etiquetas. Excitación de dos fotones también se puede utilizar para imágenes de las estructuras de colágeno endógeno mediante el aprovechamiento de las propiedades intrínsecas azul generación de segundo armónico. Generación de segundo armónico (SHG) se produce cuando dos fotones se combinan dentro de un material y emitir un fotón de la doble de la frecuencia de los fotones originales. En el tejido, de dos fotones de excitación se produce cuando la luz del láser incidente es perpendicular a la estructura de una proteína muy ordenado, como el colágeno.

Cuestiones prácticas relativas a dos fotones imágenes fueron discutidos en ^cuatro revisiones de vista ^{previa, 5.}

Discussion

En este protocolo de vídeo se muestran los procedimientos para la transferencia de células adoptivas y el aislamiento de ganglios linfáticos y la preparación requerida para la motilidad de linfocitos de imágenes en un ganglio linfático periférico. De dos fotones de imagen tiene varias ventajas sobre la imagen confocal en ambos tejidos explantados (en la foto) y en los preparativos intravital. En particular, el uso de infrarrojos excitación minimiza la dispersión de luz y permite obtener imágenes ~ 300 micras por debajo de la cápsula del ganglio linfático y más profundo en los tejidos alrededor de ^4. Por otra parte, multi-fotón de excitación se limita hasta el punto focal del objetivo, minimizando foto decoloración y daños en los tejidos a los lados del plano focal. Como con cualquier nueva técnica, sin embargo, de dos fotones de imagen no es una panacea y sus limitaciones y peligros potenciales deben tener en cuenta ^5. Entre ellas se encuentra la exigencia de que - a excepción de las señales intrínsecas, tales como la generación de segundo armónico por el colágeno de las células de interés deberán ser marcados con fluorescencia mediante sondas extrínsecas o por la expresión de proteínas fluorescentes. La impresión de este modo se crea que estas células marcadas están nadando en un vacío negro, mientras que en la verdad que estamos inmersos, e interactuar con un entorno complejo de elementos estructurales y una miríada de otras células sin etiqueta, invisible.

En los seis años desde la introducción de dos fotones de imágenes a la inmunología, esta técnica ha permitido a los investigadores para hacer frente a viejas cuestiones de visualizar de manera directa en los tejidos vivos intactos los procesos incluyendo las interacciones célula-célula, la motilidad celular y la localización, vías de señalización celular y células citotóxicas matando a los acontecimientos. El campo ha evolucionado rápidamente más allá de las descripciones fenomenológicas inicial, y análisis cuantitativos, junto con el modelado y simulación por computadora ahora están comenzando a tener sentido de cómo los movimientos celulares aparentemente caótica y las interacciones dentro de los nódulos linfáticos conducen a una respuesta inmune eficiente. Este avance es un nuevo examen en una publicación reciente ^1, que enumera más de 100 artículos que describen la aplicación de la microscopía de dos fotones de immunoimaging.