Dissektion och 2-Photon Imaging för perifera lymfkörtlar på möss

Summary

Två-foton avbildning har avslöjat lymfocyter motilitet och cellulära interaktioner inom den lymfkörtel i basala förhållanden och under ett immunsvar ^1. Här visar vi adoptiv transfer av T-celler, isolering av lymfkörtlar, och avbildning motilitet av CD4 + T celler i explanterade lymfkörtel.

Abstract

Två-foton avbildning har avslöjat en elegant koreografi motilitet och cellulära interaktioner inom den lymfkörtel i basala förhållanden och vid inledandet av ett immunsvar ^1. Här presenterar vi metoder för adoptiv transfer av märkta T-celler, isolering av lymfkörtlar, och avbildning motilitet av CD4 + T celler i explanterade lymfkörtel som första beskrivs i 2002 ^2. Två-foton avbildning av immunceller kräver att cellerna fluorescerande är märkta, antingen genom färgning med en cell tracker färgämne eller genom att uttrycka ett fluorescerande protein. Vi visar det adoptiv förfarandet för överföring av injicera celler från givare möss i svansen ven av en mottagare djur, där de hem till lymfoida organ inom ca 15-30 min. Vi illustrerar isolering av en lymfkörtel och beskriva metoder för att säkerställa korrekt montering av exciderad lymfkörtel. Andra överväganden som bra syresättning av perfusion media, temperatur, och laser makt diskuteras. Slutligen presenterar vi 3D-bilder av naiva CD4 + T-celler uppvisar steady state motilitet vid 37 ° C.

Protocol

1. Adoptiv transfer av celler:

Svansvenen eller intraokulär injektion är båda lämpliga metoder för införandet av cell tracker-märkta eller fluorescerande proteinet som uttrycker lymfocyter. I den här videon. vi visar adoptiv transfer av celler genom svansvenen injektion.

A. Material

CD4 + T-celler är märkta med 1,4 mikroM CFSE i 30 minuter vid 37 º C, tvättade två gånger, och resuspenderas i 100 mikroliter av RPMI-1640. Celler laddas i en steril 28 gauge spruta för injektion. Antalet använda celler beror på försöket görs. Normalt, 5 miljoner T-celler är nog för enkla T-cell visualisering. En gnagare restrainer för musen behövs för att förhindra skador på djur och till dig själv.

b. Säkra djuret

Musen är säkrad för adoptiv transfer genom att långsamt bakom djuret i gnagare restrainer (se video) och stänga den öppna änden av röret genom att försiktigt trycka kolven. Släpp inte av musen svansen under denna process, som en del mindre djur kan vända inne i restrainer. Denna metod hindrar djuret från att skada sig själv och från att gå under injektionen. När du ställer in gnagare restrainer du inte trycka in kolven i ytterligare än som är nödvändigt för att hålla djuret från att hoppa framåt. Dessutom gör inte in kolven mot djuret, och inte lämna djuret i restrainer under en längre tid.

C. Visualisera svansvenen

Dra försiktigt ut stjärten mot dig så att det lätt är insvept över pekfingret och höll mot insidan av fingret med tummen. Identifiera svansen ådror på båda sidan om en stolpe svansen. Visualisering underlättas genom att värma i svansen med varmt vatten och sedan torka av med etanol.

D. Injektion av celler

När ven har hittats och för in sprutan fasade sidan uppåt i en flack vinkel parallellt med ven. Väl i venen, försiktigt tryck in kolven, om du är i venen det bör finnas något motstånd mot injektionen. Om det finns något motstånd, ta bort sprutan och försöka igen på en annan plats.

Om du är i venen, sakta pressa kolven tills injektionen avslutats. Svansen skall inte bli utspänd under injektionen. Om den gör det, skulle detta innebära att nålen inte är i venen. Det är möjligt att "förlora" venen under injektionen. Om detta händer, ta ut nålen och prova injektion i en annan plats. Om du behöver försöka mer än en injektion, är det bäst att flytta svansen upp mot kroppen för musen från den ursprungliga injektionsstället. Planera för denna möjlighet genom att starta distalt på svansen för att ge dig själv utrymme för ett nytt försök på adoptiv transfer.

e. Efter injektion överväganden

Efter injektionen är klar kommer en liten back-flöde av blod från venen förekomma. Tryck försiktigt injektionsstället med en ren torka tills blödningen stannar. Ta bort kolven och låt djuret gå framåt, ut ur restrainer under lätt att hålla i svansen.

Kontrollera alltid med ditt djur omsorg utskott och djur protokoll använder för att säkerställa att du följer dessa. Det är viktigt att öva denna teknik flera gånger innan du försöker det verkliga experimentet.

2. Lymfkörtel Isolering

Isolering av lymfkörtlar för två photon avbildning kräver noggrann borttagning av rätt lymfkörtel från den omgivande vävnaden.

A. Val och placering av perifera lymfkörtlar

Val av lymfkörtlar för avbildning beror på experimentella mål. Var uppmärksam på lokal infektion eller injektion-dränerande lymfkörtlar, och välj lämplig nod för avbildning. Artikeln av Van den Broeck et al. Beskriver läge och morfologi murina lymfkörtlar i detalj ^3. I den här videon visar vi excision av sex stora perifera lymfkörtlar som lämpar sig för cell isolering eller avbildning.

b. Lymfkörtel bort:

Tänk på integriteten i vävnaden medan du tar bort lymfkörtlar. Var noga med att inte spricka kapseln eller på något sätt skada strukturen lymfkörtel. Förlust av lymfkörtel strukturell integritet äventyrar experimentet. Om det behövs, ta bort fett från lymfkörtel yta med fin dissekera (# 5 Dumont) pincett under ett dissekera mikroskop. Lymfkörtlar bör inte ha några kvar fett på ytan av noden, eftersom detta obskyra avbildning av spridning ljuset.

Korrekt excision av lymfkörtlar är också en viktig teknik för att uppträda inför den första riktiga experiment.

3. Lymfan Node Imaging Installation och Överväganden

Lymfkörteln bör fästas vid avbildning scenen, som i detta fall består av en infälld kammare. Uppvärmd, syre-perfusion media pumpas in i kammaren från ena sidan med en peristaltiska pumpar och inline värmare, och den matas via en nedåtgående uppgraderas kanal till en insamling kammare med ett vakuumrör till en insamling av avfall kolv. I vårt system är lymfkörtel nedsänkt i 37 ° C media och super-perfusion med medicinsk kvalitet carbogen (5% CO _2, 95% O _2). Temperaturen i perfusion medierna bör registreras så nära lymfkörtel som möjligt. Just ditt system kan kräva variationer i media flödet och scenografi för att rymma mikroskop scenen och objektiv.

A. Lymfkörtel imaging konfiguration:

Som visas i videon, vi säkra lymfkörtel genom att först fästa det, medullär nedåt (för att bilden T-eller B-zoner cellen med hjälp av en upprätt mikroskop) till en plast täckglas, klippa till lämplig storlek. Det är viktigt att använda en giftfri vävnad lim (vi använder VetBond ™ från 3M Corporation).

Den täckglas är säkrad i det strömmande media genom att placera en liten klick silikonfett på undersidan av locket glida, sedan följa det till glaset basen av avbildning kammaren.

b. 2-Photon avbildning överväganden:

Flera faktorer kan orsaka lymfocyter att sluta röra: temperatur som är för hög eller för låg, över lasereffekt, kompression eller andra skador på lymfkörtel, och brist på syre. Skador på grund av alltför lasereffekt eller temperaturer> ~ 39 ° C är oåterkallelig.

Om celler är svagt, är det normalt sett bättre att öka detektorn vinst eller cellen-märkning protokoll stället för att använda en högre lasereffekt att visualisera celler. Optimering av märkning eller uttryck av fluorescerande proteiner kan krävas för att få fluorescens ovanför bakgrunden autofluorescens. Med rimlig vinst och laser inställningar makt, om en två-log förskjutning av fluorescens över baslinjen (mätt med flödescytometri) är rimligt för cell visualisering.

Med avstämbara två-photon lasrar bör våglängd används för excitation vara lite mindre än dubbelt enda fotonen excitation högst det fluoroforen som avbildas. I två-photon experiment med mer än en etikett eller fluorescerande proteinet kan det vara nödvändigt att experimentera med excitationsvåglängden används för att hitta de optimala inställningarna för båda etiketter. Två-foton excitation kan också användas för att bilden endogent kollagen strukturer genom att utnyttja den inneboende blå andra övertonen generation. Andra harmonic generation (SHG) inträffar där två fotoner förenas i ett material och avger en enda foton av dubbla frekvensen av den ursprungliga fotoner. I vävnaden, sker två-photon excitation när händelsen laserljus är vinkelrät mot en mycket beställde proteinstruktur som kollagen.

Praktiska frågor om två-photon avbildning diskuterades i förhandsgranskning betyg ^{4, 5.}

Discussion

I den här videon protokoll visar vi de förfaranden som adoptiv cell överföring och lymfkörtel isolering och förberedelser som krävs för avbildning lymfocyter motilitet i en perifer lymfkörtel. Två-foton avbildning har flera fördelar jämfört konfokala bildhantering i både explanterade vävnader (bilden) och i intravital förberedelser. Särskilt användning av infraröd excitation minimerar ljusspridning och möjliggör avbildning ~ 300 mikrometer under kapsel av lymfkörteln och djupare i vissa vävnader ^4. Dessutom är flera fotonen excitation begränsad till fokus för målet att minimera foto blekning och vävnadsskada ut sida fokalplanet. Som med alla nya tekniken är dock två-photon avbildning ingen patentlösning och dess begränsningar och potentiella fallgropar måste hållas i minnet ^5. Bland dessa är kravet på att - med undantag för inneboende signaler som andra harmonic generation av kollagen-celler av intresse fluorescerande måste märkas med yttre givare eller uttryck av fluorescerande proteiner. Intrycket är således skapas dessa märkta celler simmar i ett svart tomrum, medan det i sanning de är nedsänkta i och interagera med en komplex miljö av strukturella element och en mängd andra omärkta, osynliga celler.

Under de sex år som gått sedan införandet av två-photon avbildning för immunologi, har denna teknik får forskarna att lösa långvariga frågor genom att direkt visualisera i intakta levande vävnader processer inklusive cell-cell interaktioner, cell motilitet och lokalisering, cellulära signalvägar och cytotoxiska celler döda händelser. Fältet har snabbt utvecklats bortom första fenomenologiska beskrivningar och kvantitativa analyser tillsammans med datormodellering och simulering börjar nu att förstå hur den till synes kaotiska cellulära rörelser och interaktioner inom lymfkörtlar leda till en effektiv immunsvar. Denna utveckling är omfattande över en nyligen publicerad ^1, som listar över 100 artiklar som beskriver tillämpningen av två-photon mikroskopi för immunoimaging.