Summary
Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut für sieben Tage. Kurz gesagt, wurde ein steriles Filterpapier verwendet, um die neuronalen Netzhaut abheben von der RPE und Ort Photorezeptor Seite nach oben auf einem Einsatz von einem maßgeschneiderten Stand angehoben.
Abstract
Es ist ein anerkannter Bedarf an In-vitro-Modellen, zu ersetzen oder reduzieren kann Tierversuch. Porcine Netzhaut hat eine ähnliche neuronale Struktur der menschlichen Netzhaut und ist daher eine wertvolle Arten für das Studium Mechanismen der menschlichen Netzhaut Verletzungen und degenerativen Erkrankungen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut vor Augen von einem Schlachthof erhalten isoliert. Nach dem Entfernen der vorderen Segment wurde ein Trepan Klinge verwendet, um mehrere neurale Retina-Bruch-Membran-RPE-Aderhaut-Sklera Explantate aus dem hinteren Bereich des ausgewachsenen Schweinen Augen zu schaffen. Ein Stück sterile Filterpapier wurde verwendet, um die neuronalen Netzhaut abhebt von jedem Explantat. Das Filterpapier-Retina-Komplex wurde kultiviert (Photorezeptor Seite nach oben) auf dem Gipfel eines Einsatzes, die vom Boden der Kulturschale mit einem maßgeschneiderten Stand gehalten wurde. Der Stand ermöglicht eine gute Zirkulation des Kulturmediums auf beiden Seiten der Netzhaut. Insgesamt ist dieses Verfahren einfach, reproduzierbar und erlaubt Erhaltung der einheimischen retinalen Struktur für mindestens sieben Tage, so dass es ein nützliches Modell für eine Vielzahl von morphologischen, pharmakologische und biochemische Untersuchungen an Säugetieren Netzhaut.
Protocol
1. Einen maßgeschneiderten stehen für Zellkultur-Einsätzen
Die Basis eines 5 ml Pipettenspitze (ISC BioExpress, # P-3250 bis 19) hat einen Innendurchmesser von 13 mm, das entspricht genau dem Boden Größe (12,6 mm, Außendurchmesser) einer 10 mm (Innendurchmesser) NUNC Zelle Kultur einzufügen (8 um, Polycarbonat-Membran, Thermal, # 137443). Um den Stand, wurde die Pipette nahe der Basis geschnitten, um einen 6 mm langen Hohlzylinder erzeugt. Dann wurden Stücke aus der Seite des Zylinders entfernt mit einer Flamme erwärmt Klinge bis 3 Beine (4 mm in der Höhe) unter einem Ring (2 mm Höhe), die die Höhe der Einsätze um etwa 5 mm angehoben erstellen.
2. Herstellung von sterilen Filterpapier für den Anbau und die Kultur der Schweine Netzhaut
Whatman 4M Filterpapier (Kat. Nr. 1004) wurde in eine runde Form (6,3 mm im Durchmesser) mit einem kleinen, dreieckigen Griff, der für die Bewegung der Filterpapier in einem Glasrohr zur Sterilisation oder wenn die Netzhaut angebracht wurde verwendet wurde geschnitten (wie gezeigt, in dem Video).
3. Vorbereitung der Netzhaut Explantate
Eyes aus 5 - bis 9-Monate alten, 150-230 lbs, waren amerikanische Yorkshire Schweine aus einem örtlichen Schlachthof innerhalb von drei Stunden Enukleation (Transport auf Eis) gewonnen. Nach der Ankunft, die Augen von fremden Gewebe gereinigt wurden, tauchte in betadine Lösung (10% Povidon-Iod, der Purdue Frederique Company, Stamford, CT) und zweimal in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM mit 1g / l Glucose, L-Glutamin, und Natriumpyruvat, CellGro-mediatech Inc., Manasse, VA) mit 2,5 g / ml Amphotericin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Das vordere Segment wurde entfernt, so dass die neuronalen Netzhaut. Six-mm Trepan Klingen (Storz Ophthalmic-Bausch und Lomb, Manchester, MO) wurden verwendet, um äquatorialen, voller Dicke hinteren Segment Explantate abgeschnitten. Die Netzhaut wurde anschließend durch leichtes Anlegen ein Stück trockenes steriles Filterpapier auf die Ganglienzellschicht, Abheben der neuralen Netzhaut, und indem das Filterpapier mit angeschlossenem Netzhaut auf die Kultur legen, Photorezeptoren nach oben abgezogen. Der Einsatz wurde dann in Kulturmedium gebracht, so dass Sie sicher, dass zur Deckung der Netzhaut, in einer 12-well Kulturschale (Fisher). Mehrere Explantate wurden routinemäßig und erhielt kultivierte aus einem einzigen Auge.
4. Gewebekultur
Die Retina wurde in Minimum Essential Eagle-Medium (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, ergänzt mit 0,2 mg / ml Glutamin, 10 pg / ml Insulin vom Schwein, 1 mM Pyruvat, 0,1 mM L-Ascorbinsäure, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B (Antibiotika antimykotische: Sigma, St. Louis, MO), und kohlensäurehaltiges mit befeuchteten 5% CO 2, Balance Luft, bei 37 ° C. Das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt.
Tissue kann verwendet werden, behandelt mit einer Vielzahl von Reagenzien oder Sonden oder links für nachfolgende biochemische oder morphologische Analysen unbehandelt. Der folgende Abschnitt beschreibt Verfahren, um konsistente voller Dicke der Netzhaut Querschnitte erstellen.
5. Sectioning
- Mit einem Kryostat
- Fix Netzhautgewebe in 4% parafomaldehyde über Nacht bei 4 ° C;
- Das Gewebe spülen kurz mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS);
- Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus dem Filterpapier, während es in PBS in einer 35 mm Schale mit einem Dissektionsmikroskop;
- Transfer-Gewebe zu 30% Saccharose und halten über Nacht bei 4 ° C;
- Saug entfernt die überschüssige Lösung um das Gewebe zu erhalten, ausreichend Tissue-Tek Medium (OCT Compound 4583), um Gewebe decken, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 2 Stunden einweichen, um das Gewebe durchdringen;
- Baue einen quadratischen Rahmen (10 mm x 10 mm, 5 mm Höhe) mit Dentalwachs und legen Sie sie in das Gewebe, fügen Sie mehr Tissue-Tek Medium mit dem Rahmen (sicherstellen, dass die Gewebeprobe ist flach) und in einen Gefrierschrank zu füllen (- 20 ° C) für mindestens 1 Stunde;
- Übertragen Sie die gefrorene Probe blockieren, um eine Probe-Plattform (sicherstellen, dass die Sample-Block steht senkrecht auf der Plattform);
- Montieren Sie die Probe-Plattform in einem vorgekühlten Kryostaten (-20 ° C, Leica, CM1900) und stellen Sie sicher, dass der Block steht senkrecht auf der Klinge;
- Entfernen Sie das Wachs und den Rahmen zu blockieren, bevor Schneiden des Gewebes in der gewünschten Dicke;
- Setzen Sie die Teile auf Gelatine-behandelten Objektträgern.
- Mit einem Vibratom
- Fix und spülen Sie das Gewebe wie oben für den Kryostat beschrieben;
- Legen Sie das Gewebe in vorgewärmte, geschmolzen 4% Agar in einen kleinen Behälter und halten bei 4 ° C, bis der Agar erstarrt vollständig;
- Mit einem scharfen Messer auf die Agar in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe Innenverkleidung;
- Kleben Sie die Sample-Block auf einer Vibratom Probenhalter mit Krazy Kleber (stellen Sie sicher, das Stück Gewebeprobe steht senkrecht auf der Plattform von the Probenhalter, dh senkrecht zur Klinge) und montieren Sie die Halterung auf einem Vibratom Schneidesystem (Leica, Series 1000) mit der Probe Block vollständig im eisigen Wasser getaucht;
- Schneiden Sie die Sample-Block in 50 Abschnitte um und legen Sie sie auf Gelatine-behandelten Folien mit einer weichen Bürste.
6. Immunhistochemie
Verwenden Sie Standard-Protokoll. Immunolabeled dicke Schnitte können mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Morphologie wurde während des Zeitraums von sieben Tagen der Kultur erhalten. Bilder der Netzhaut vor und nach der Kultivierung sind in dem Video.
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Discussion
Vision-Forscher haben eine Vielzahl von Netzhaut-Kultur etabliert, darunter organotypischen Systeme, um eine Vielzahl von Themen, wie Retina Stammzelltransplantation 1, retinale Regeneration 2 und exogene Genexpression 3-5 studieren. Allerdings ist erwachsener Säugetiere Netzhaut schwer aufrecht zu erhalten in vitro, vor allem aufgrund der hohen Energiebedarf der Photorezeptoren 6. Koizumi et al. Beschrieben ein Kaninchen Netzhaut organotypischen Kultur, in dem die Sauerstoffversorgung für Photorezeptoren durch eine Erhöhung der Höhe der Kultur einzufügen und Rühren das Kulturmedium verbessert wurde. Sie haben erfolgreich gepflegt Erwachsenen Netzhautgewebe für bis zu sechs Tagen 4,5. Kobuch et al. Beschrieben eine Perfusionskultursystem für ausgewachsenen Schweinen Netzhaut und Pigmentepithel (RPE) und konnten den organotypischen Gewebe für mindestens 10 Tage 7 zu halten. Allerdings war das Verfahren zur Herstellung der Netzhaut-RPE-Aderhaut Blatt für Labor-Manipulation kompliziert und benötigt spezielle Tools. Darüber hinaus benötigt jeder Explantation eigenen Perfusion System macht in-vitro-Kultur von mehreren Gewebeproben umständlich. . Kaempf et al erfolgreich anderen organotypischen Kultur-Modell von erwachsenen Säugetieren neurosensorischen Netzhaut in Co-Kultur mit RPE geschaffen, sondern nur zeigten die Ergebnisse für einen 3-Tage-Kultur, die das langfristige Überleben des Gewebes war nicht 8 getestet.
In diesem Manuskript, beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Protokoll für organotypischen Kultur des ausgewachsenen Schweinen neuralen Netzhaut in einer Weise vorgehen, wie sie früher für Kaninchen Netzhaut 4 mit den folgenden Funktionen beschrieben:
- Erstellung einer einfachen Technik, um eine benutzerdefinierte Widerstand zu leisten, um die Höhe der Kultur einfügen zu erhöhen, eine gute Sauerstoffversorgung für die ganze Netzhaut Explantation. Mit einem 5 ml Pipettenspitze an den Stand sorgt dafür, daß der Stand autoklaviert werden kann und dass die Höhe kann eingestellt werden, falls gewünscht.
- Kultur der Netzhaut mit den Photorezeptoren Schicht nach oben, um die Ganglienzellschicht entgegen. Auf diese Weise haben die Photorezeptoren Zugang zu Sauerstoff erhöht und Agitation zur weiteren Steigerung der Sauerstoffversorgung ist nicht erforderlich.
- Minimierung der mechanischen Trauma. Die Netzhaut Explantate auf sterilem Filterpapier vor dem Schälen sie aus der RPE befestigt und sind dann auf dem Filterpapier kultiviert, wodurch mechanische Belastung des Gewebes und verhindern retinalen Eisstockschießen.
- Konsistenz in der Größe des retinalen Explantate. Da ein Trepan wird verwendet, um die Explantate zu schaffen, wird jeder Netzhaut Explantation der gleichen Größe, wodurch es leicht, die Ergebnisse der verschiedenen Behandlungen zu vergleichen.
- Erhaltung der Morphologie. Struktur von Schweinen Netzhaut in dieser Kultur System bleibt für mindestens sieben Tage.
Da die Schweine-und menschlichen Netzhaut sehr ähnlich sind in Bezug auf die Zelle und Morphologie, Gefäßmuster, Schichtdicke und andere physiologische Eigenschaften 9,10, bietet der organotypischen Kultur von Schweinen Netzhaut ein attraktives Tiermodell für die Untersuchung Manifestationen der menschlichen Netzhaut-Erkrankungen, Degenerationen und Verletzungen. Dieses System kann besonders wichtig in Fällen, in denen in vitro Experimente an menschlichen Netzhaut sind nicht möglich, da zum Teil auf den Mangel an hochwertigen menschlichem Gewebe führen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH EY 012031 (ET-A), eine Auszeichnung von der FM Kirby Foundation (ET-A), Forschung zur Erblindung, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) Prevent unterstützt, The Eye Institute of New Jersey (MAZ), die Joseph J. und Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ) und die Janice Mitchell Vassar und Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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