Summary
Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиней в течение семи дней. Короче говоря, стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от от ПЭС и место фоторецепторов вверх на вставке поднятых на заказ стенда.
Abstract
Существует спрос на признанных в пробирке моделей, которые могут заменить или уменьшить экспериментах на животных. Свиной сетчатки имеет аналогичную структуру нейронов в сетчатке глаза человека и, следовательно, ценных пород для изучения механизмов сетчатки человека травм и дегенеративных заболеваний. Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиньи изолированы от глаза получена из скотобойни. После удаления переднего сегмента, лезвие трепан была использована для создания нескольких нейронных сетчатки Бруха мембранно-РПЭ-сосудистое-склеры эксплантов из заднего сегмента глаза взрослой свиньи. Кусок стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от каждого эксплантов. Фильтровальная бумага-сетчатки комплекс культивировали (фоторецепторов стороной вверх) на вершине вставку, которая проходила вдали от нижней части культуры блюдо на заказ стенда. Стенд позволяет для хорошей циркуляции питательной среды по обе стороны от сетчатки. В целом, эта процедура проста, воспроизводимые, и позволяет сохранение родного сетчатки структуры, по крайней мере за семь дней, что делает ее полезной модели для различных морфологических, фармакологических и биохимических исследований на млекопитающих сетчатки.
Protocol
1. Создание заказных стенд для вставки культуре клеток
База 5 мл пипетки (ISC BioExpress, № Р-3250-19) имеет внутренний диаметр 13 мм, что идеально соответствует нижней размера (12,6 мм, внешний диаметр) 10 мм (внутренний диаметр) Nunc ячейки культуры вставки (8 мкм, поликарбонат мембраны, тепловые, # 137443). Для того, чтобы стоять, пипетка была отрезана у основания, чтобы произвести 6 мм полый цилиндр. Затем части были удалены из стороны цилиндра использованием пламени подогревом лезвия, чтобы создать 3 ноги (4 мм в высоту) под кольцо (2 мм в высоту), которые вызывают высота вставки примерно на 5 мм.
2. Подготовка стерильной фильтровальной бумаги для крепления и культуры свиного сетчатки
Ватман 4М Фильтровальная бумага (Cat № 1004) был разрезан на круглой формы (6,3 мм в диаметре) с небольшой, треугольной ручкой, который использовался для перемещения фильтровальной бумаги в стеклянную трубку для стерилизации или один раз в сетчатку была прикреплена (как показано на видео).
3. Подготовка сетчатки эксплантов
Глаза от 5 - до 9-месячного, 150-230 кг, американский Йоркшир свиней были получены из местной скотобойни в течение трех часов энуклеации (перевозимых на льду). Прибыв на место, глаза были очищены от посторонних ткани, смоченной в бетадин решение (10% повидон-йод, компании Purdue Фредерик, Stamford, CT) и дважды промывают изменения Eagle Дульбеко Средняя (DMEM с 1 г / л глюкозы, L-глутамин, и пируват натрия, Cellgro-Mediatech Inc, Манассия, В. А.) с добавлением 2,5 мкг / мл амфотерицина B (Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Переднего сегмента был удален, выставляя нейронных сетчатки. Шесть-мм трепан лопастей (Storz Офтальмология-Бауш и Ломб, Манчестер, штат Миссури) были использованы, чтобы сократить экваториальный, на всю толщину задних эксплантов сегменте. Сетчатка была впоследствии снимают, осторожно применения кусок сухой стерильной фильтровальной бумаги на слой ганглиозных клеток, отрывая нейронных сетчатки, и размещение фильтровальную бумагу с прикрепленными на сетчатке культуры вставки, фоторецепторы вверх. Вставки помещается в культуральной среде, убедившись, что для полного покрытия сетчатки, в 12-и культуре блюдо (Фишер). Несколько эксплантов были получены в плановом порядке и культурных из одного глаза.
4. Культуры ткани
Ткани сетчатки культивировали в минимально необходимого среднего Орла (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc, Роквилл, штат Мэриленд), рН 7,4 с добавлением 0,2 мг / мл глутамина, 10 мкг / мл свиного инсулина, 1 мМ пирувата, 0,1 мМ L-аскорбиновой кислоты, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина B (противогрибковым антибиотикам: Sigma, Сент-Луис, Миссури), и газированные с увлажненной 5% CO 2, баланс воздуха, при 37 ° C. Средний был обменен каждые два дня.
Ткань может быть использован, получавших различные реагенты или датчиков, или не лечить для последующих биохимических или морфологического анализа. Ниже раздел описывает процедуры создания последовательной полную толщину сетчатки сечений.
5. Секционирование
- Использование Криостат
- Fix ткани сетчатки в 4% parafomaldehyde течение ночи при 4 ° С;
- Промойте ткань кратко фосфатным буферным раствором (PBS);
- Осторожно снимите ткань фильтровальную бумагу пока он находится в PBS в 35 мм с помощью блюдо рассечение микроскопа;
- Передача ткани до 30% сахарозы и держать в течение ночи при 4 ° С;
- Всасывающая излишки раствора вокруг ткани, добавьте достаточное ткани-Tek среды (октябрь 4583 соединений), чтобы покрыть ткань, и пусть он помочь при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы проникать в ткани;
- Сборка площади кадра (10 мм х 10 мм, 5 мм) с зубным воском и место его вокруг ткани; добавить больше ткани-Tek среду, чтобы заполнить кадр (убедитесь, что образец ткани плоская) и поместить в морозильную камеру (- 20 ° С) в течение не менее 1 часа;
- Передача замороженных блоков образец образец платформы (убедитесь, что образец блока вертикального на платформе);
- Горы образец платформы в предварительно охлажденный криостате (-20 ° C, Leica, CM1900) и убедитесь, что блок вертикального на лезвие;
- Удаление воском и рама блока перед срезов ткани на нужной толщины;
- Место разделы по желатин обработанные слайды.
- Использование Vibratome
- Fix и полоскания тканей, как описано выше криостат;
- Место ткани в предварительно нагретую, растопленное 4% агара в небольшой контейнер и хранить при температуре 4 ° С до агар застывает полностью;
- Используйте острое лезвие для обрезки агар в небольшой блок с образца ткани внутри;
- Клей образец блока на vibratome держатель образца с Krazy клея (убедитесь, что кусочек ткани образец вертикального на платформе йэлектронной держателя образца, т. е. перпендикулярно к лезвию) и установите держатель на vibratome секционирования системы (Leica, серия 1000) с образцом блок полностью погружен в ледяную воду;
- Вырезать образец блока в 50 мкм разделов и разместить их на желатин обработанные слайды с мягкой щеткой.
6. Иммуногистохимия
Используйте любой стандартный протокол. Immunolabeled толстых секций могут быть просмотрены с помощью конфокальной микроскопии.
7. Представитель Результаты:
Морфология была сохранена в течение семи дней культуры. Изображения сетчатки до и после культивирования доступны в видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Видение исследователи установили различные сетчатки системы культуры, в том числе органотипической систем, для изучения различных вопросов, таких как сетчатки трансплантации стволовых клеток 1, 2 регенерации сетчатки и экзогенных экспрессии генов 3-5. Тем не менее, взрослый млекопитающих сетчатки трудно поддерживать в пробирке, в основном за счет высоких энергетических потребностей фоторецепторов 6. Коидзуми и соавт. Описал кролика сетчатки органотипической системе культуры, в которой кислород для фоторецепторов был уменьшаются за счет повышения высоты культуры вставки и перемешивания культуральной среды. Они успешно эксплуатируются взрослой ткани сетчатки на срок до шести дней 4,5. Kobuch и соавт. Описал системы перфузии культуры для взрослых сетчатку свиней и пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и смогли сохранить органотипической ткани, по крайней мере 10 дней 7. Тем не менее, процедура подготовки сетчатки-РПЭ-сосудистой листов для лабораторных манипуляций была сложной и требует специальных инструментов. Кроме того, каждый эксплантов требуется своя система перфузии решений в пробирке культуру несколько образцов тканей громоздким. . Kaempf и др. успешно создал еще один органотипической модель культуры взрослых млекопитающих нейросенсорной сетчатки во взаимодействии культуры с НПП, но только показал результаты на 3-дневный культуры; долгосрочного выживания ткани не тестировался 8.
В этой рукописи, мы описываем простые и воспроизводимые протокол для органотипической культуру взрослой свиньи нейронных сетчатки принятия подход, аналогичный тому, что описано выше для кролика сетчатки 4 со следующими характеристиками:
- Создание простой метод для создания пользовательского стоять поднять высоту культуру вставки, что обеспечивает хороший запас кислорода для всей эксплантов сетчатки. Использование 5 мл пипетки, чтобы создать стенд уверяет, что стоять можно автоклавировать и что высота может регулироваться по желанию.
- Культура сетчатки с фоторецепторов слоем вверх, в отличие от слоя клеток ганглия. Таким образом, фоторецепторы более широкий доступ к кислороду, и агитация еще больший прирост кислорода не является необходимым.
- Минимизация механической травмы. Сетчатки эксплантов крепятся к стерильной фильтровальной бумаги перед пилингом их от ПЭС и затем культивируются на фильтровальной бумаге, тем самым уменьшая механическую нагрузку на ткани сетчатки и предотвращения скручивания.
- Последовательность в размере сетчатки эксплантов. Потому что трепан используется для создания эксплантов, каждый сетчатки эксплантов имеет тот же размер, что делает его легко сравнивать результаты различных методов лечения.
- Сохранение морфологии. Структура свиного сетчатки в этой культуре системы остается неизменным в течение по крайней мере за семь дней.
Учитывая, что свиньи и сетчатке глаза человека очень похожи с точки зрения распределения клеток и морфология, сосудистого рисунка, толщины слоя и другие физиологические характеристики 9,10, органотипической культуры свиного сетчатки обеспечивает привлекательные модели животных для изучения проявлений человеческой заболеваний сетчатки, вырождения, а также травмы. Эта система может быть особенно важно в тех случаях, когда в пробирке эксперименты на сетчатке человеческого глаза невозможно выполнить из-за, в частности, с отсутствием высококачественных тканей человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант EY 012 031 (ET-), награда от FM Кирби Foundation (ET-), исследований в области профилактики слепоты, Inc (МАЗ), Нью-Джерси Лайонс Ай исследовательский фонд (МАЗ), Eye Institute в Нью-Джерси (МАЗ), Джозеф Дж. и Маргарита DiSepio Retina исследовательского фонда (МАЗ), и Дженис Митчелл Вассар и Эшби Митчелл стипендий (АМК).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
