Summary
Aquí se describe una técnica coste-efectiva para la cultura de la retina organotípicos adulto porcino durante siete días. En pocas palabras, un papel de filtro estéril se utilizó para levantar la retina neural fuera de la EPR y los fotorreceptores hasta el lugar parte de una inserción que plantea un soporte a medida.
Abstract
Existe una demanda reconocida por los modelos in vitro que pueden sustituir o reducir los experimentos con animales. Retina porcina tiene una estructura similar neuronal de la retina humana y por lo tanto, es una especie valiosa para el estudio de los mecanismos de lesión de retina humana y las enfermedades degenerativas. Aquí se describe una técnica coste-efectiva para la cultura de la retina organotípicos adulto porcino aislado de ojos obtuvo de un matadero. Después de retirar el segmento anterior, una hoja de trépano se utiliza para crear múltiples neural retina, la membrana de Bruch-RPE-coroides-esclera explantes del segmento posterior de ojos porcinos adultos. Un pedazo de papel de filtro estéril se utilizó para levantar la retina neural lejos de cada explante. El filtro de papel-retina complejos, se cultivó (lado de los fotorreceptores hasta) encima de una inserción, que se celebró fuera de la parte inferior de la placa de cultivo por un soporte a medida. El soporte permite una buena circulación del medio de cultivo a ambos lados de la retina. En general, este procedimiento es simple, reproducible, y permite la preservación de la estructura de la retina nativos por lo menos durante siete días, por lo que es un modelo útil para una variedad de estudios morfológicos, farmacológicos y bioquímicos en la retina de mamíferos.
Protocol
1. Hacer un soporte hecho a medida para las inserciones de cultivo celular
La base de un 5 ml punta de la pipeta (ISC BioExpress, # P-3250-19) tiene un diámetro interior de 13 mm, que se adapta perfectamente al tamaño inferior (12,6 mm, diámetro exterior) de 10 mm (diámetro interior) de células NUNC insertar la cultura (8 micras, de policarbonato de membrana, térmica, # 137443). Para hacer la base, la pipeta se cortó cerca de la base para producir un cilindro hueco de 6 mm de largo. Luego, las piezas fueron retirados de la parte del cilindro con una hoja de la llama calienta para crear tres patas (4 mm de altura) en un anillo (2 mm de altura), que elevó la altura de los insertos de aproximadamente 5 mm.
2. Preparación de papel de filtro estéril para la unión y la cultura de la retina porcina
4M papel de filtro Whatman (Cat. No. 1004) fue cortado en forma circular (6,3 mm de diámetro) con una pequeña asa, de forma triangular que se utiliza para mover el papel de filtro en un tubo de vidrio para la esterilización o una vez que la retina se adjunta (como muestra en el video).
3. Preparación de explantes de retina
Ojos de 5 - a 9 meses de edad, 150-230 libras, American cerdos Yorkshire se obtuvieron de un matadero local en las tres horas de la enucleación (transportados en hielo). A su llegada, los ojos se limpiaron de tejido extraño, sumergido en una solución de betadine (10% de povidona yodada, la compañía Purdue Frederique, Stamford, CT) y se lavó dos veces en Dulbecco modificado del medio Eagle (DMEM con 1 g / L de glucosa, L-glutamina, y piruvato de sodio, Cellgro-mediateca Inc., Manasés, VA) suplementado con 2,5 mg / ml de anfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). El segmento anterior fue removido, dejando al descubierto la retina neural. Seis hojas mm trépano (Storz Oftálmica-Bausch and Lomb, Manchester, MO) se utiliza para cortar ecuatorial, de espesor total de explantes del segmento posterior. La retina se despegó posteriormente fuera aplicando suavemente un trozo de papel de filtro seco estéril sobre la capa de células ganglionares, el levantamiento de la retina neural, y colocar el papel de filtro con retina aplicada en el encaje cultural, los fotorreceptores hacia arriba. El inserto se colocaron en medio de cultivo, asegurándose de cubrir la totalidad de la retina, en una placa de cultivo de 12 pocillos (Fisher). Explantes múltiples se obtuvieron de manera rutinaria y cultivadas a partir de un solo ojo.
4. De cultivo de tejidos
El tejido de la retina se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle (MEM, Gibco-Invitrogen, Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, suplementado con 0,2 mg / ml de glutamina, 10 mg / ml de insulina porcina, 1 mM piruvato, 0,1 mM ácido L-ascórbico, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina B (antibióticos antimicóticos: Sigma, St. Louis, MO), y la gaseada, con humidificado 5% de CO 2, el aire el equilibrio, a 37 ° C. Medio fue cambiado cada dos días.
Los tejidos se pueden utilizar, tratados con una variedad de reactivos o sondas, o se deja sin tratamiento para su posterior análisis bioquímico o morfológico. La siguiente sección describe los procedimientos para crear consistente de todo el espesor de retina secciones.
5. Seccionamiento
- El uso de un criostato
- Fix tejido de la retina en el 4% parafomaldehyde la noche a 4 ° C;
- Enjuague el tejido brevemente con tampón fosfato salino (PBS);
- Retire con cuidado el tejido del papel de filtro mientras está en PBS en una placa de 35 mm utilizando un microscopio de disección;
- La transferencia de tejido al 30% de sacarosa y mantener la noche a 4 ° C;
- Aspiración lejos el exceso de solución de todo el tejido, agregar suficiente Tissue-Tek medio (compuesto octubre 4583) para cubrir el tejido, y deje reposar a temperatura ambiente durante 2 horas a penetrar en el tejido;
- Construir un marco cuadrado (10 mm x 10 mm, 5 mm de altura) con cera dental y el lugar que todo el tejido; añadir más Tissue-Tek medio para llenar el encuadre (asegúrese de que la muestra de tejido plano) y el lugar en un congelador (- 20 ° C) durante al menos 1 hora;
- Transferencia del bloque de muestra congelada a una plataforma de muestra (asegúrese de que el bloque de la muestra está en posición vertical a la plataforma);
- Montaje de la plataforma de la muestra en un criostato pre-enfriado (-20 ° C, Leica, CM1900) y asegúrese de que el bloque es perpendicular a la hoja;
- Quite la cera y el bloque de marco antes de seccionar el tejido en el espesor deseado;
- Coloque las secciones de gelatina tratados con diapositivas.
- El uso de un Vibratome
- Fijar y aclarar el tejido como se describe arriba para el criostato;
- Coloque el tejido en el pre-calentado, agar fundido al 4% en un recipiente pequeño y mantenga a 4 ° C hasta que el agar se solidifica por completo;
- Utilizar una cuchilla para cortar el agar en un bloque pequeño con la muestra de tejido en el interior;
- Cola de la muestra en un bloque de soporte de muestra vibratome con pegamento Krazy (asegúrese de que la pieza de muestra de tejido es vertical a la plataforma de the titular de la muestra, es decir, perpendicular a la hoja) y montar el soporte en un sistema vibratome de seccionamiento (Leica, serie 1000) con el bloque de la muestra completamente sumergido en agua helada;
- Cortar el bloque de la muestra en secciones de 50 micras y colocarlos en gelatina tratados con diapositivas con un cepillo suave.
6. Inmunohistoquímica
Usar cualquier protocolo estándar. Immunolabeled de espesor pueden ser vistos con un microscopio confocal.
7. Los resultados representativos:
Morfología se conservan durante el período de siete días de la cultura. Imágenes de la retina antes y después del cultivo están disponibles en el video.
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Discussion
Investigadores de la visión han establecido una variedad de sistemas de cultivo de la retina, incluyendo los sistemas de organotípicos, para estudiar una variedad de temas, tales como el trasplante de células madre de la retina 1, la regeneración de la retina 2, y la expresión de genes exógenos 3-5. Sin embargo, la retina de mamíferos adultos es difícil de mantener in vitro, principalmente debido a las altas demandas de energía de los 6 fotorreceptores. Koizumi et al. Describe un conejo sistema de cultivo organotípico la retina en la que se ha mejorado el suministro de oxígeno para los fotorreceptores, elevando la altura de la inserción de la cultura y la agitación del medio de cultivo. Ellos lograron mantener el tejido de la retina para adultos de hasta seis días 4,5. Kobuch et al. Describe un sistema de cultivo en perfusión de la retina adulto porcino y el epitelio pigmentario retiniano (EPR) y fueron capaces de mantener el tejido organotípicos por lo menos 10 días 7. Sin embargo, el procedimiento para la preparación de las hojas de la retina-coroides-EPR para la manipulación de laboratorio era complicado y requiere de herramientas especiales. Además, cada explante requiere su propio sistema de perfusión de decisiones en cultivo in vitro de muestras de tejido complicado múltiples. . Kaempf et al éxito creó otro modelo de cultivo organotípico de adultos retina neurosensorial en los mamíferos co-cultivo con EPR, pero sólo mostró los resultados de un cultivo de 3 días, la supervivencia a largo plazo del tejido no se ha probado 8.
En este artículo, se describe un protocolo simple y reproducible para la cultura de los adultos organotípicos retina neural porcina adoptar un enfoque similar al descrito anteriormente para la retina de un conejo 4 con las siguientes características:
- Creación de una técnica sencilla para hacer un soporte personalizado para elevar la altura de la inserción de la cultura, garantizar el suministro de oxígeno bueno para el explante retina completa. Con una punta de pipeta de 5 ml para crear el soporte asegura que el soporte puede ser esterilizado en autoclave y que la altura se puede ajustar si se desea.
- La cultura de la retina con la capa de fotorreceptores mirando hacia arriba, a diferencia de la capa de células ganglionares. De esta manera, los fotorreceptores tienen un mayor acceso al oxígeno, y la agitación para aumentar aún más el suministro de oxígeno no es necesario.
- Minimización de los traumatismos mecánicos. Los explantes de retina se unen a un papel de filtro estéril antes de pelarlas del EPR y luego se cultivan en el papel de filtro, reduciendo así el estrés mecánico sobre el tejido y la prevención de la retina se encrespa.
- Consistencia en el tamaño de los explantes de retina. Debido a que un trépano se utiliza para crear los explantes, cada uno de explantes de retina es del mismo tamaño, haciendo más fácil comparar los resultados de los diversos tratamientos.
- La preservación de la morfología. Estructura de la retina porcina en este sistema de cultivo se mantiene intacta por lo menos durante siete días.
Dado que la retina humana y porcina son muy similares en cuanto a la distribución de células y la morfología, patrón vascular, espesor de la capa, y otras características fisiológicas de 9,10, la cultura organotípicos de retina porcina proporciona un modelo animal atractivo para el estudio de las manifestaciones de enfermedades de la retina humana, degeneraciones y lesiones. Este sistema puede ser especialmente importante en los casos en los experimentos in vitro en la retina humana son imposibles de realizar debido, en parte, a la falta de alta calidad de los tejidos humanos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EY 012.031 (ET-A), un premio de la Fundación FM Kirby (ET-A), Investigación para Prevención de la Ceguera, Inc. (MAZ), The New Lions Jersey Eye Research Foundation (MAZ), El Eye Institute de Nueva Jersey (MAZ), J. José y Margarita DiSepio Retina del Fondo de Investigación (MAZ), y el Vassar Janice Mitchell y Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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