Termodynamik för membranprotein Folding Mätt fluorescensspektroskopi

Summary

Denna video artikeln närmare den experimentella förfarande för erhållande av Gibbs fria energi av membran protein folding av tryptofan fluorescens.

Abstract

Membran protein folding är ett framväxande ämne med både grundläggande och hälsorelaterade betydelse. Överflödet av membranproteiner i celler ligger bakom behovet av omfattande studie av vikning av denna allestädes närvarande familj av proteiner. Dessutom har framsteg i vår förmåga att karakterisera sjukdomar som förknippas med felveckade proteiner motiverade betydande experimentella och teoretiska insatser inom området proteinveckning. Snabba framsteg inom detta viktiga område är tyvärr hindras av den inneboende utmaningar som är förknippade med membranproteiner och komplexitet hopfällningsmekanism. Vi presenterar här en experimentell metoder för att mäta termodynamiska egendom Gibbs fria energi utvecklas i frånvaro av denatureringsmedel, Δ g · _{H 2 O,} för ett representativt integrerad membranprotein från E. coli. Detta protokoll är inriktat på tillämpningen av fluorescens spektroskopi för att bestämma balansen populationer av vikt och ovikt stater som funktion av denatureringsmedel koncentration. Experimentella överväganden för beredning av syntetiska lipid blåsor samt viktiga steg i dataanalysen förfarandet är markerade. Denna teknik är mångsidig och kan bedrivas med olika typer av denatureringsmedel, bland annat temperatur och pH, ​​samt i olika vikning miljöer av lipider och miceller. Det nuvarande protokollet är en som kan generaliseras till alla membran eller lösligt protein som uppfyller kriterier som diskuteras nedan.

Protocol

1. Beredning av ~ 50 små nm diameter Unilamellar Blåsor (SUV) för Membrane Protein Folding

1. En lösning av 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) lipider i kloroform köps och aliquotted i rena glasflaskor på 20 mg per injektionsflaska kvantiteter för förvaring. Ett lager av kvävgas tillsätts i varje flaska för att förhindra lipid oxidation, och flaskorna är förseglade med lock och parafilm. Injektionsflaskorna förvarats i en -20 ° C frys fram till användning.
2. En injektionsflaska som innehåller en delmängd av 20 mg lipid i kloroform används för varje experiment. Innehållet i flaskan torkas med hjälp av en ström av kvävgas i 1 timme tills inga lösningsmedel kvarstår.
3. Torkade lipider är suspenderade i 1 ml 20 mM kalium fosfatbuffert (pH = 7,3) med en sonicator vattenbad i ~ 30 sekunder. Denna lösning av suspenderade lipid kommer att visas molnigt, och överförs till en plast 15-mL rör med konisk botten. Ytterligare 1 ml alikvot av fosfatbuffert läggs till den tomma glasflaska som ursprungligen innehöll fett och ultraljudsbehandling upprepas, lösningen läggs sedan till samma 15-ml tub. Denna process upprepas totalt 4 gånger tills den sista volymen i röret är 4 ml, vilket resulterar i en lipid koncentration på 5 mg / ml i detta bestånd vesikler lösning.
4. Den 4 mL volym lipid vesikler lösning är placerad i ett varmt (~ 30 ° C) vattenbad och sonicated med en ultrasonicator microtip i 1 timme vid 50% intermittens. Syftet med vattenbad är dubbel. Först förhindrar det fett lösningen blir för varm på grund av sonication processen. För det andra, ser varmt bad att temperaturen i vattenlösning lipid lösningen förblir ovanför tvåskiktsmembran fasövergången temperatur under ultraljudsbehandling, för DMPC, är denna övergång temperaturen ~ 23 ° C.
5. Den sonicated lösningen passera genom en 0,22 ìm spruta filter för att avlägsna skräp från sonicator spets, och det filtrerade lösningens jämvikt över natten vid 37 ° C.

2. Provberedning för Initial Fluorescens Fälla Curve

1. En stamlösning 10 M urea i 20 mM fosfatbuffert (pH 7,3) görs. Det är viktigt att vatten tillsättas till den fasta (och inte tvärtom) på grund av den stora mängden av urea har en betydande volym i lösningen. Denna urealösning kan göras genom att lägga till lösta ämnen till en ren, tom flaska och tillsätta vatten upp till den avsedda slutliga volym. Denna lösning kan kräva uppvärmning i vattenbad eller på en värmeplatta med omrörning för att lösa upp lösning. Urea är hygroskopiskt och därför bör den faktiska koncentrationen av urea stamlösningen bestämmas med hjälp av brytningsindex. ¹
2. Ett lager buffertlösning 20 mm fosfat (pH 7,3) görs.
3. En stamlösning av ovikt protein är beredd. Detta lager protein lösning bör ha en koncentration av ~ 200 mikroM protein i 8 M urea, 20 mM fosfatbuffert.
4. Prover för fluorescens studier bereds på följande sätt. Lämpliga volymer av lager protein (avsnitt 2.3), lager lipid lösning (5 mg / ml lipid, avsnitt 1), lager 10 M urea-lösning (avsnitt 2.1), och lager fosfatbuffert (avsnitt 2.2) kombineras för att göra prover som innehåller ~ 4 mikroM protein, 1 mg / ml lipid, och 0 till 8 m urea i en 1 M steg. Den totala volymen av varje prov är 200 mikroliter. Ett exempel kalkylblad (tabell 1) ingår som listar volymer som krävs med hjälp av en 200 mikroM lösning lager protein.
5. Blankprover görs som beskrivs i avsnitt 2.4 är dock protein inte till. I stället för protein, 4 maj mikroliter av en 8 M urea-lösning tillsättas så att halterna av andra komponenter är identiska med de i avsnitt 2.4. Dessa ämnen används för att subtrahera spridning och annan bakgrundsinformation signal som visas i fluorescens spektra av protein.
6. Prover från punkterna 2.4 och 2.5 får inkubera vid 37 ° C i minst 2 timmar innan mätning av fluorescens spektra att säkerställa en fullständig vikning och jämvikt.

3. Mätning av fluorescens Spectra

Tryptofan fluorescens av varje prov och blank mäts med en steady-state fluorometer. Fluorescens spektra bör registreras med excitation våglängd på 290 nm för att undvika excitation av tyrosin rester, och skannade 305 till 500 nm. Typiska ingång och utgång bandpass är 3 nm. Våglängden inkrement och integration tid kan optimeras för signal-brus-förhållande. Typiska värden för våglängd steg och integration tid är 1 nm / steg och 0,5 sek / steg, respektive. Membranproteiner i allmänhet lägga till syntetiska lipider endast när temperaturen är över tvåskiktsmembran fasövergång temperatur. Därför i detta fall av DMPC är temperaturen i provet hålls konstant vid 30 ° C. En microvolume kvarts kyvett med 160 mikroliter kapacitet utnyttjas i dessa experiments.

4. Generering av Initial Fälla Curve och uppskattning av Gibbs fria energi av membranprotein Fälla

1. Fluorescens spektra i form av en xy dataset läses in program som Igor Pro, Matlab, Ursprung, eller Excel.
2. Signalen från urea och lipid vesikler bakgrunden måste dras på följande sätt:
   Spektrum A = rå fluorescens spektrum av protein i närvaro av lipid blåsor och specifika koncentrationen av urea.
   Spectrum B = råa fluorescens spektrum av motsvarande blankprov som innehåller lipid blåsor och samma koncentration av urinämne som i spektrum A, inget protein är i blankprov.
   Korrigerad Spectrum = Spectrum A - C * spektrum B. C är en skalär normalt lika med 1,0. I vissa fall är C är mindre än eller större än 1,0 på grund av spridning frågor som orsakar över-eller under-subtraktion nära ~ 305-320 nm.
3. Den våglängd som ger maximal fluorescens, λ _max är tabellform från korrigeras spektra för varje ureakoncentrationen. Ett typiskt värde för fullt utfälld membranprotein är 350 nm medan den för vikta protein ~ 330 nm. Tabulerade våglängder konverteras till bråkdel ovikt genom att konvertera de olika λ _max-värden (~ 330 till ~ 350 nm) till intervallet 0,0 till 1,0 att korrelera λ _max värde bråkdel av ovikt befolkningen. Till exempel motsvarar en λ _max på 330 nm till 0,0 motsvarar 350 nm till 1,0, och 340 nm motsvarar 0,5 i form av bråk ovikta. Denna del av ovikt protein är sedan plottas mot karbamid koncentration. Som nämnts ovan bör urea koncentrationen bestämmas experimentellt genom att mäta brytningsindex.
4. Vi förutsätter att proteinet kan existera i en av två stater: vikta eller ovikta. Handlingen i bråk ovikt, f, jämfört med urea koncentrationen, C, kan passa till ekvationen: ²
   
   Koefficienten m motsvarar graden av förändring av fri energi med avseende på denatureringsmedel koncentration, och C _m motsvarar mittpunkten urea koncentration vid vilken den vikta befolkningen lika ovikt befolkningen. Dessa värden är montering variabler från minsta kvadrat montering av data analysprogram. R (0.001987 kcal / mol • K) är den gas lag konstant och T är temperatur (303 K).
5. Koefficienterna erhålls från passar används för att bestämma Gibbs fria energi (kcal / mol) utspelas i avsaknad av urea: .

5. Optimerad Fälla Curve för mer exakt mätning av Gibbs fria energi för Fälla.

1. Den utspelas kurvan ovan visar utbudet av urea koncentrationer som orsakar den största förändringen i λ _max. Denna serie är vanligtvis små, och de flesta utspelar sker inom detta lilla område. För exakt bestämma den fria energi utvecklas, är ytterligare prover som analyserats i denna region för att få en tomt som innehåller många datapunkter som krävs för optimerad minsta kvadrat montering. Till exempel, om det protein utspelar sig mellan 2 och 4 M urea, kan proven göras som innehåller 2 - 4 m urea i 0,2 M steg för att mer exakt avslöja formen av denna viktiga region i den pågående kurvan. Det är inte nödvändigt att mäta tomt spektra vid varje ureakoncentrationen, det räcker att mäta ett tomt spektrum varje ~ 0,5 M steg.
2. Den fria energin utvecklas från den här tomten kan skilja sig något från den som erhålls i den ursprungliga utspelas kurvan, utan speglar en mer exakt värde.

6. Representativa resultat:

Exempel på	slutlig [Urea], M	lager protein (mikroliter)	lager lipider (mikroliter)	lager 10 M urea (mikroliter)	lager buffert (mikroliter)
1	~ 0,16	4	40	0	156
2	1	4	40	20	136
3	2	4	40	40	116
4	3	4	40	60	96
5	4	4	40	80	76
6	5	4	40	100	56
7	6	4	40	120	36
8	7	4	40	140	16

Tabell 1. Volym stamlösningar krävs för att göra fluorescens prover

Figur 1. Tryptofan fluorescens spektra av ~ 5 mikroM representant membranprotein som innehåller en enda tryptofan restprodukt. (A) Raw fluorescens spektra av protein (spektrum A från 4,2), (b) råa fluorescens spektra av tomma (spektrum B från 4,2), (c) rättad spektrum från 4,2.

Figur 2. Korrigerad tryptofan fluorescens spektra av membranprotein från Figur 1 för många urea koncentrationer.

Figur 3. Fälla kurva som erhålls från data i figur 2, med lämplig att ekvation i 4,4. Gibbs fria energi beräknas enligt avsnitt 4.5.

Discussion

Den nuvarande protokollet beskriver generationen utspelas kurvor av membran-associerade proteiner och peptider som innehåller tryptofan rester. Här är det antas att tryptofan fluorescens reflekterar om proteinet är vikt och infogas i syntetiska lipid blåsor eller ovikta i lösning. Ytterligare antaganden, till exempel två-state-vikning och linjärt beroende av fri energi med denatureringsmedel koncentration, görs i den aktuella rapporten,. Ändring av dessa antaganden resulterar i olika ekvationer ² Den experimentella protokoll kan enkelt ändras för att utnyttja olika spektroskopiska observabler, till exempel som cirkulär dikroism, absorption eller fluorescens från ett yttre färgämne, ³ samt gelelektrofores. ⁴ Dessutom olika denatureringsmedel, såsom guanidinium, sura lösningar, eller temperatur, samt alternativa lipider / blåsor, exempelvis anjoniska lipider, stora unilamellar blåsor, eller miceller kan utnyttjas. ^5,6 Slutligen kan protokollet tillämpas på alla membranprotein, membran-associerade peptid, och lösligt protein / peptid som uppfyller kriterierna för reversibla vikning, och som uppvisar en spektroskopiska eller andra observerbara markör för olika konformationsanalys stater. I fallet av lösliga proteiner är blåsor uppenbarligen utelämnats i protokollet.

Gibbs fria energi utvecklas ger en inblick i noncovalent interaktioner som stabiliserar biomolekyler. I vårt labb har vi mätt utspelas kurvor för mutanter av yttre membran Protein A (Ompa) som innehåller enstaka tryptofan rester på olika platser, och rapporterade att de mutanter skulle destabiliseras i förhållande till vild-typ protein som innehåller fem infödda tryptofan rester. ⁷ Dessa utspelas studier kompletteras med andra tekniker, inklusive vibrationsspektroskopi, att belysa molekylära detaljer, till exempel, vätebindningar och parvisa interaktioner som ligger bakom variationen i stabilitet. Sammanfattningsvis kan den relativt okomplicerad teknik utvecklas kurvor tillämpas på membran och lösliga proteiner att avslöja termodynamik förknippas med proteinveckning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMPC	Avanti Polar Lipid, Inc	850345C
Urea	MP Biomedicals	04821527
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	P288
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P285