Immuncytokemi: Mänskliga neurala stamceller

Summary

Immuncytokemi är en kraftfull metod för att bestämma närvaro, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa antal steg som gör det möjligt för en att bevara antikroppar och få ut det mesta av ens färgning.

Abstract

Immuncytokemi är en mycket kraftfull och ganska enkel metod för bestämning av förekomst, subcellulära lokalisering, och relativ förekomst av ett antigen av intresse, oftast ett protein, i odlade celler. Detta protokoll utgör en enkel att följa serie steg som gör det möjligt för forskare att bevara primära och sekundära antikroppar samtidigt få hög kvalitet, reproducerbar kvalitativa och kvantitativa data ur sin färgning. Det finns två aspekter av detta protokoll som bidrar till att bevara volym antikroppar som behövs för färgning. För en, är de celler som odlas på små, runda täckglas som placeras i brunnar i en vävnadskultur tallrik. Efter fixering kan cellerna täckglasen tas bort från brunnar i plattan. För antikroppar färgning är täckglas med celler inverterad på en liten droppe antikropp lösning på parafilm och är täckt med en andra bit parafilm att förhindra uttorkning. Med denna metod är endast ~ 25 ìl av antikroppar lösning som krävs för varje täckglas (eller prov) för att färgas. Detta protokoll beskriver immunfärgning av mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), men kan användas till många andra celltyper.

Protocol

Dag 1: Förbereda tyska Glas Täckglas och såmaskiner celler

OBS: Tyska glas täckglas är ofta att föredra för odling primära neurala stamceller och nervceller. Vi använder följande rengörings-protokollet för att förbättra cell adhesion och spridning. Placera täckglas i en liten rack som gör att vätskan tillgång till båda sidor av täckglas. Först inkubera täckglas i 1% Liquinox i 10 minuter, följt av tre tvättar med avjoniserat vatten. Se till att inga såpbubblor kvar. Nästa, inkubera glider i 1M HCl i 30 minuter, följt av tre tvättar med avjoniserat vatten. Torr täckglas vid 65 ° C över natten. Överför täckglas till en glasskål och autoklav för att sterilisera.

1. I en vävnadskultur huva, plats sterilt täckglas i en lämplig storlek och platta.
   
   
2. Coat täckglas med laminin för cell adhesion. Inkubera täckglas i 10 mikrogram / ml poly D-Lysin (PDL) i sterilt vatten i 5 minuter i rumstemperatur. Ta bort PDL och inkubera täckglas i 20 mikrogram / ml laminin i EMEM i 4 timmar eller över natten, i ett 37 ° C vävnadskultur inkubator.
   
   
   
   1. Obs: Se Passaging mänskliga neurala stamceller artikeln ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) och Counting mänskliga neurala celler Stem artikeln ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) att lära sig att resuspendera och räkna hNSPCs.
      
      
3. Skölj laminin-belagd täckglas med PBS och celler frö i varje täckglas som innehåller bra med en viss densitet (vi använder ofta en första bordläggning täthet av 100,000-300,000 celler / ml för celler som vi plätering för immunfärgning).
   
   
4. Placera plattan i 37 ° C vävnadsodling inkubator och låta celler att hålla sig till täckglas (vanligtvis minst 4 timmar krävs).

Dag 2: fastställande Permeabilizing, blockering, och lägga till primär antikropp till celler

Observera: Vi använder följande 4% paraformaldehyd fixativ för att bevara cellmorfologin. Receptet innehåller en pH-övergången att låta paraformaldehyd att gå i lösning. Vi föredrar denna metod snarare än att använda värme för att upplösa paraformaldehyd eftersom högre temperaturer kan leda till uppkomsten av myrsyra, vilket kan öka bakgrundsfärgning när du använder fluorescens. Vissa komponenter i fixativ hjälpa till att bevara cytoskelettala struktur (MgCl ₂ och EGTA), medan andra hjälper till att bevara den totala morfologi (sackaros).

4% Paraformaldehyd fixativ för celler

Reagenser och steg:	Belopp för 100 ml fixativ:
MilliQ vatten	75 ml
Paraformaldehyd (väger i dragskåp)	4 g
10N NaOH, rör om och tillsätt droppvis tills lösningen försvinner	efter behov
10X PBS	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sackaros	4 g
6N HCl, titreras till pH 7,4	efter behov
MilliQ vatten	ta med till 100 ml
Förvaras vid 4 ° C i upp till 1 vecka. Värmas upp till 37 ° C före användning

1. På bänken, ta bort materialet och lägga uppvärmd fixeringsmedel. Inkubera i 5-15 minuter (beroende på antigen att upptäcka, vi brukar använda 10 minuter). Utför detta och följande steg vid rumstemperatur.
   
   
2. Kasta fixativ till en lämplig behållare, så många institutioner hanterar paraformaldehyd som farligt avfall. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, 5 minuter varje gång. När du tar bort lösningar från cellerna, vara försiktig så att sug inte torkar ut cellerna. Också alltid ha nästa lösning till hands för att lägga till cellerna innan du tar bort den lösning som rockar dem så cellerna inte får torka.
   
   
3. Om antigenet av intresse är inne i cellen måste cellmembranet göras genomsläppligt för att möjliggöra inträde av antikroppen. För att permeabilize celler, använder en ny 0,3% Triton X-100 lösning i PBS. Pipettera långsamt eftersom Triton är trögflytande, och se till att tvättmedlet är helt upplöst i PBS innan du lägger till celler. Permeabilize celler i 5 minuter, följt av att tvätta cellerna tre gånger med PBS, 5 minuter varje gång.
   
   
4. Cellerna måste behandlas med ett blockerande medel för att förhindra att icke-specifik bindning av antikroppen. Vi använder bovint serumalbumin (BSA) som en blockerande medel. Den blockerande lösningen görs genom att lösa 5% BSA i PBS (på en rocker eller rotator eftersom det tar tid att lösa upp) så att filtrera solution med 0,45 ìm spruta filter. Block celler i 5% BSA / PBS-lösning i 1 timme i rumstemperatur.

Späd den primära antikroppen (som förhoppningsvis specifikt för proteinet av intresse) till ett förutbestämt koncentration i 1% BSA / PBS (beredd genom utspädning från 5% BSA / PBS). Placera utspädd primär antikropp (30 l per 25 mm täckglas, 20 l per 18 mm täckglas, 15 l per 12 mm täckglas) på en glasskiva täckt med parafilm. Plocka upp täckglas med fasta celler, vänd så att cellerna nedåt och lägg den över antikroppen lösning så att cellerna är i kontakt med antikroppen. Placera en andra parafilm remsa över hela konstruktionen. Inkubera vid 4 ° C över natten.

Dag 3: Tvätt, sekundär antikropp inkubation, Nuclear Stain och Montering

1. Ta försiktigt bort den översta parafilm band och plocka upp täckglas, invertera den och lägg den tillbaka in i plattan med PBS i varje brunn för tvättar så att cellerna uppåt.
   
   
2. Tvätta cellerna tre gånger med PBS, 5 minuter varje gång.
   
   
3. Välj en sekundär antikropp som kommer att upptäcka den primära antikroppen, till exempel om den primära antikroppen gjordes i en kanin, bör den sekundära antikroppen känner igen kanin IgG. Var noga med att också matcha antikroppen isotyp (IgG, IgM, etc). Om du använder flera primära antikroppar, se till att de är från olika arter eller isotyper, och planerar att upptäcka med olika markörer knutna till sekundära antikroppar. Till exempel kan du använda ett anti-kanin sekundärt kopplad till en röd fluoroforen med en anti-mus sekundärt kopplad till en grön fluoroforen. Inkubera cellerna i sekundär antikropp lösning som spätts till en lämplig koncentration i 1% BSA i 2 timmar i mörker vid rumstemperatur, med samma teknik som för primära (steg inte visas i videon). Volymen av sekundära antikroppar som behövs för odling kan vara något större än för den primära antikroppen om sekundära lagras som en glycerol-lösning (40 l per 25 mm täckglas, 30 l per 18 mm täckglas, 25 l per 12 mm täckglas) .
   
   
   • Anm: Om du använder fluorescerande molekyler för att visualisera den sekundära antikroppen behöver det prov som skall skyddas från ljus när den sekundära antikroppen har lagts till. Inkubera i mörker eller i en täckt folie tallrik.
     
     
4. Ta försiktigt bort täckglasen från parafilm som beskrivits för den primära antikroppen. Tvätta cellerna två gånger med PBS, 5 minuter varje gång, följt av en 1 minut inkubation i 2 mikrogram / ml Hoechst nuclear fläcken spätts i PBS (om en nukleär motfärg föredras). Om Hoechst fläcken är gammal och signalen är för svag kan du öka inkubationstid och / eller koncentrationen. Efter inkubation med Hoechst, tvätta en gång med PBS i 5 minuter.
   
   
5. Den täckglas bör monteras på en bild med montage media för visualisering på ett mikroskop. I de fall där en fluorescerande molekyl används för visualisering av den sekundära antikroppen bör montering medier innehåller ämnen för att minimera fotoblekning. Vi använder Vectashield som ett montage media för fluorescens. Placera en lämplig storlek droppe Vectashield på ett objektglas (12 l per 25 mm täckglas, 6 l per 18 mm täckglas, 3 l per 12 mm täckglas).
   
   
6. Försiktigt plocka upp täckglas och skölj tillbaka med avjoniserat vatten för att avlägsna salter (från PBS). Dab bort överflödigt vatten på en kimwipe eller pappershandduk, och låg på droppe Vectashield med celler nedåt. Placera täckglas på i en vinkel och låt sjunka långsamt för att undvika att droppa luftbubblor. Märk bilden med datum och eventuella prov information.
   
   
7. Låt objektglasen med täckglas för att torka (i mörker) så sug bort överflödig Vectashield från hela täckglaset kanten. Den täckglas kanter kan nu tätas med nagellack, om så önskas (speciellt användbart om täckglas ska visas på ett inverterat mikroskop). Vi lagrar vanligtvis våra bilder i en -20 ° C frys.

Discussion

Detta protokoll beskriver en immunfärgning förfarande för hNSPCs som minimerar volym antikroppar som behövs och ger pålitlig cellfärgning. Förfarandet som beskrivs är bäst för intracellulära antigener, men kan modifieras för att färga molekyler på cellens yta eller för att förbättra färgning av cytoskelettet.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous