Summary
Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).
Abstract
Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (μCT).
Hoge resolutie μCT is een zeer veelzijdige toch nauwkeurig (1-2 micron van de resolutie) techniek voor 3D-onderzoek van de ex-vivo biologische monsters 1, 2. In tegenstelling tot electron tomography, de μCT maakt het onderzoek van de tot 4 cm dik monsters. Deze techniek vergt slechts enkele uren van de meting in vergelijking met de week in de histologie. Bovendien heeft μCT niet op 2D stereologische modellen, zo kan aanvullen en in sommige gevallen kan zelfs vervangen histologische methoden 3, 4, die zowel tijdrovend en destructief. Monsterconditionering en positionering in μCT is eenvoudig en vereist geen hoog vacuüm of lage temperaturen, hetgeen nadelig kan zijn van de structuur. Het monster wordt geplaatst en geroteerd 180 ° of 360 ° tussen een microfocused x-ray-bron en een detector, die een scintillator en een nauwkeurige CCD-camera, Voor elke hoek een 2D-opname wordt gemaakt omvat, en vervolgens het gehele volume is gereconstrueerd met behulp van een van de verschillende beschikbare algoritmen 5-7. De 3D-resolutie toeneemt met de daling van de rotatie stap. De huidige video-protocol geeft de belangrijkste stappen in de voorbereiding, immobilisatie en positionering van het monster, gevolgd door beeldvorming met een hoge resolutie.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Na het uitpakken van het weefsel die moet worden onderzocht, kan gemineraliseerde weefsels worden geplaatst in het instrument en afgebeeld. Het imago van de muis dijbeen moet men de volgende stappen:
- Verwijder de post mortem been van een C57/Bl6 embryo 18,5 dagen postceutus (E18.5).
- Sluit de smalle kant van een polystyreen pipetpunt (20-200 pl) met behulp van epoxyhars of een andere lijm, en vul de tip met de werkende buffer (PBS of andere).
- Past goed de been in de punt en sluit de andere kant met parafilm plaat.
- Plaats de pipetpunt in een geschikte houder en volg het protocol uit hoofdstuk 3. Voor het visualiseren van het dijbeen van de muis been embryo, is het instrument set 40 KV en 200 uA. Voor 8μ resolutie 1000 projectie beelden met een 4x vergroting moeten worden verworven.
- Niet-gemineraliseerde weefsels in eerste instantie worden gefixeerd en gekleurd om de X-ray verzwakking van het weefsel van de rente te verhogen met behulp van een van de vele beschikbare protocollen 8,9. Voor de rat longen en soortgelijke monsters, de voorbereiding protocol is:
- Orthotopical implantatie van niet-kleincellige longcarcinoom (NSCLC) NCI-H460 op naakt rat longen
- Longkanker knobbeltjes start wordt detecteerbaar 4 weken vanaf de implantatie
- Offer van de rat en onmiddellijk bezielen met een zoutoplossing gemengd met heparine
- Injecteren met een verdunde oplossing van Microfil (Flowtech), (2 ml van de verbinding, oplossing, 3 ml van het oplosmiddel en 0,3 ml verharder) in de linker ventrikel naar de bronchiale circulatie vlek
- Pak de longen en het hart van de rat
- Immobiliseren van het monster (zie hoofdstuk 2 van het protocol) door het aanbrengen van het goed in een 50 ml plastic buisje
- Maak een verzadigde ethanol sfeer door het plaatsen op de bodem van de buis een doek bevochtigd met ethanol
- Lijm of schroef de buis in een houder van het instrument
- Ga verder met het instellen van de imaging parameters (hoofdstuk 3). Voor de volledige beeldvorming van de rat de longen van de bron is ingesteld op 40KV en 100 uA. Om te bereiken 16μ resolutie moet men 2500 projectie beelden te verwerven bij een vergroting van 0.5x.
2. Voorbeeld immobilisatie
Bij een hoge resolutie, is het belangrijk om te voorkomen dat elke verandering in het monster positie tijdens de meting. Hiervoor wordt het monster goed vast in een plastic ontvanger die de grootte past. Polystyreen pipetpunten, plastic pasteurpipetten of speciaal gebouwde plastic houders worden gebruikt in dit opzicht. Volgens de experimentele eisen, kan het monster worden onderzocht in de lucht of ondergedompeld in ethanol of buffer-oplossingen. Typische immobilisatie en de uiteindelijke plaatsing van het been van de muis embryo in het instrument is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. Uiteindelijke positionering van de embryonale muis been in de micro-CT instrument.
3. Instellen van acquisitie parameters: x-ray spanning en stroom, CCD belichtingstijd
- Geplaatst in een houder, wordt het monster gezet in de rotatie fase van het instrument
- Een eerste x-ray beeld wordt genomen met de spanning en de stroom willekeurig in te stellen.
- Als het beeld te donker is, moet men het aantal fotonen eerste verhoging, zodat verhoging van een beetje de huidige. Als dit niet genoeg is, een licht moet de energie van de x-ray fotonen te verhogen, dat wil zeggen de spanning op de x-ray tube.
- Als het beeld te helder is, moet een eerste daling van de spanning, dan de huidige.
- De helderheid van het beeld kan worden vergroot door binning. Binning van 1 houdt rekening met de intensiteit van elke pixel in het beeld, terwijl binning van 2 neemt de som van elke matrix van 2x2 pixels. Het beeld wordt ongeveer 4 keer helderder dan in het geval van binning 1, maar zal de helft van de resolutie.
- Na het instellen van de optimale helderheid, heeft men het optimaliseren van de belichtingstijd van de camera tussen de beste contrast compromis aan de ene kant en een redelijke duur van het experiment op een andere zijde.
- Het contrast van beelden, vooral van de lage absorberende monsters, kan worden verbeterd door het gebruik van filters, die het foton flux te verminderen, met name die van de lagere energie fotonen.
4. Voorbeeld positionering
- Kies de werkende vergroting. Mogelijke keuzes zijn 0.5x, 4x, 10x, 20x en 40x. Het gezichtsveld neemt af met toenemende vergroting.
- Verkrijg de optimale resolutie en het gezichtsveld door het instellen van de afstanden tussen de x-ray source en het monster en tussen het monster en de detector. Het verhogen van de bron te proeven afstand vermindert het gezichtsveld en verhoogt de resolutie. Monster detector afstand is het tegenovergestelde effect.
Het hele veld te worden bekeken in 3D moet aanwezig zijn in degeprojecteerde beeld op alle hoeken. Men moet dit controleren door het draaien van het monster bij verschillende hoeken en door het brengen van de steekproef zo dicht mogelijk bij de rotatie-as. Hiervoor moet men de volgende stappen:
- Neem een afbeelding op 0 graden, en draai vervolgens het monster bij -20 graden. Als het gewenste volume heeft zijdelings verschoven, men moet haar positie te corrigeren door de herpositionering van de rotatie-as.
- Na correctie is de steekproef te worden gedraaid op een andere hoek en de positie gecorrigeerd opnieuw tot het gebied van belang is binnen het beeld in alle hoeken -90 tot 90 graden.
5. Hoge resolutie tomogram
- Tijdens de meting, het monster is gedraaid door een kleine hoek op een moment en op elke hoek een geprojecteerde beeld wordt genomen. Het totaal aantal opnamen is altijd een compromis tussen de gewenste resolutie aan de ene kant en de tijd van de meting en de bestandsgrootte op een andere zijde. Zoals weergegeven in figuur 2, elke projectie omvat alle segmenten in de steekproef boven elkaar boven elkaar, en kan daarom niet onthullen de 3D-structuur van het monster.
Figuur 2. Projectie beelden van de longen van de rat bij 0 ° (A), 45 ° (B) en 90 ° (C) rotatiehoek.
- Pas na het nemen van foto's projecteren op zijn minst tussen de -90 en 90 graden, kan men overgaan tot de reconstructie van het monster volume. Reconstructie duurt tussen de 10 min en 2 uur, afhankelijk van de gebruikte software en van het aantal projecties. Nogmaals, de uiteindelijke kwaliteit van de 3D-beeld is een compromis tussen de gewenste resolutie en de tijd die men wil besteden aan en de grootte van het resulterende bestand.
6. Afbeelding schaal kalibratie
De pixel-niveau (waarde) in een gereconstrueerd beeld is uniek voor dat beeld. Om te vergelijken van twee verschillende beelden, een unieke intensiteit schaal moet worden opgelegd aan elke afbeelding. Voor deze
- Voer een tomografie met een standaard fantoom met dezelfde experimentele omstandigheden als voor de steekproef
- Kalibreer het voorbeeld met de waarden verkregen voor het fantoom. De meest voorkomende schaal is de Hounsfield (of CT) schaal. Voor 4x vergroting van de achtergrond waarde van 15.000 (voor water of PBS) werd vervangen door 0 en de maximale waarde van 35.000 voor het bot werd vervangen met de standaard Hounsfield waarde van 3000. Andere pixelwaarden het gevolg van lineaire interpolatie of extrapolatie op basis van deze grenzen.
7. Beeldverwerking en analyse
Na het behalen van hoge resolutie beelden, moet men om relevante informatie te extraheren met behulp van beeldanalyse-software. De software-pakket te gebruiken moet zijn ontworpen om te werken met zeer grote bestanden (tot 20Gb).
8. Representatieve resultaten
Een weergave van een dijbeen van een C57/Bl6 muis op embryonale dag 18,5 (E18.5) - vier dagen na de opening van het mineralisatie proces is weergegeven in figuur 3. De minerale lagen zijn duidelijk zichtbaar (wit), terwijl de zachte weefsels zijn niet zichtbaar in dit preparaat. We 1000 projectie beelden nam met een lineaire vergroting van 4x. De uiteindelijke resolutie is 8 micron. Een zorgvuldige analyse van het volume rendering weergegeven in figuur 1, laat zien dat het bot volume fractie (de fractie van het bot volume dat wordt ingenomen door gemineraliseerd weefsel) is 0.18, en het bot mineraal dichtheid is 723 mg / cm 3. Deze waarden kunnen we deze structuur te vergelijken met botten in andere stadia van ontwikkeling.
Figuur 3. Verschillende voorstellingen van een 3D-beeld van een muis dijbeen embryo. Het transversaal (dwarsdoorsnede) (A), worden de sagittale (medio-laterale) sectie (B) en een snapshot van het volume rendering (C) weergegeven.
Figuur 4 toont een 3D-beeld van de longen van een vrouwelijk naakt rat (RNU), 12 weken oud, orthotopically geïmplanteerd met niet-kleincellige longcarcinoom (NSCLC) NCI-H460. 2500 projectie foto's zijn genomen met een lineaire vergroting van 0,5 x, waardoor een uiteindelijke resolutie van 16 micron. Het beeld toont de Microfil gekleurde bloedvaten (tot 20 micron diameter). Het beeld analyse toont aan dat vier weken na implantatie, meerdere kanker knobbeltjes worden gevormd. Ze zijn voor een aanzienlijk deel van de long volume (17%). Het merendeel van de pulmonale aankleuring werd gevonden in de perifere gebieden van de tumoren. Aanzienlijk, zoals weergegeven in de figuur 4B, een aantal bloedvaten aanwezig zijn ook binnen de knobbeltjes, die volgens voorlopige analyse ongeveer 3% van hun volume.
Figuur 4. 3D-beeld van kanker knobbeltjes groeien in een ratlong. Een snapshot van het volume rendering (A) en een deel door het volume (B) worden weergegeven. De kanker nodules zijn gemarkeerd met pijlen.
Film 1. Volume rendering van de muis dijbeen in Figuur 1. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Volume rendering van de rat longen in figuur 2. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 3. Serial delen via de longen. De knobbeltjes verschijnen als grijze gebieden in het grootste deel van de plakjes. Klik hier om de film te bekijken.
Discussion
C57/Bl6 muis op embryonale dag 18,5 (E18.5) is vier dagen na de opening van het mineralisatie proces. In deze fase van ontwikkeling, is de toekomst bot gemaakt van vele lagen van gemineraliseerde osteoids, duidelijk te zien in figuur 3. Op dit punt moet men benadrukken dat gemineraliseerde weefsels kunnen worden gevisualiseerd op een lagere resolutie met verschillende instrumenten die minder monsters behandeling vereisen. Het huidige protocol (en de micro-CT instrument dat wordt gebruikt in het) naast het verstrekken van een hogere resolutie, biedt de hoogste flexibiliteit voor de gebruiker om de beste geometrische parameters voor de meting te kiezen.
De resultaten in figuur 4 blijkt dat in de orthotoop longkanker diermodellen, menselijke niet-kleincellige longkanker kan werving van de bloedvaten en neovascularisatie induceren. Wij zijn van mening dat het longweefsel niet werd verplaatst, noch heeft zijn vorm veranderd tijdens de meting. De gebruiker moet speciale voorzorgsmaatregelen nemen om dergelijke veranderingen tijdens een tomografie te voorkomen. Voor sommige monsters, vooral voor de zachtere weefsel, moet men op te bouwen speciale holding apparaten die perfect de steekproef immobiliseren tijdens de meting. Helaas is de aanwezigheid van hoge lekkage van contrastmiddel in de omgeving van de tumoren voorkomen betrouwbare kwantificering van de perifere bloedvaten. Als gevolg daarvan worden de beelden aangetast door een aantal vlekken middel vooral aan de randen, die duidelijk aanwezig is in films 2 en 3. We konden niet voorkomen dat deze lekkage, maar de nuttige informatie over de kanker knobbeltjes, met inbegrip van hun grootte, vorm en de aanwezigheid van innerlijke bloedvaten werd niet beïnvloed. We kunnen duidelijk concluderen dat in ieder geval voor de bronchiale verkeer die hier is onderzocht, perifeer bloedtoevoer neemt deel aan tumor perfusie, met enkele perfusie ook aanwezig in de tumor.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De studies werden uitgevoerd bij de Irving en Cherna Moskowitz Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.
We zijn dankbaar Orna Yeger voor haar hulp bij het ontwerpen en het uitvoeren van deze protocol.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
References
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50, 2-13 (2010).
- Bauer, J. S., Link, T. M.
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).
- Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23, 59-66 (1998).
- Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods. IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).
- Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT. Med Phys. 27, 754-772 (2000).
- Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT. Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).
- Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med Phys. 31, 305-313 (2004).
- Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. X-ray high-resolution vascular network imaging. J Microsc. 215, 139-148 (2004).
