Summary
Общий протокол для изучения вторжения в клетки хозяина от бактериальных патогенов, уделяя особое внимание
Abstract
Здесь мы опишем, как мы изучаем вторжения в человеческих эндотелиальных клеток бактериальных патогенов золотистый стафилококк. Общий протокол может быть применен к изучению клеточных вторжения практически любой culturable бактерии. Этапы, на которых отдельные аспекты вторжения можно изучать, например, роль перестройки актина или кавеол, будет выделен. Клетки-хозяева выращивают в колбах и в готовом для применения высевают в 24-луночных содержащие Thermanox покровные. Использование покровные позволяет последующим удалением клеток из скважин для уменьшения помех от белков сыворотки крови наносили на сторонах скважин (к которым золотистого стафилококка бы приложить). Бактерии выросла до требуемой плотности и промывают, чтобы удалить секретируемых белков (например, токсины). Покровные стекла с вырожденным слоев эндотелиальные клетки переносятся в новый 24-луночного содержащие свежую культуральную среду перед добавлением бактерий. Бактерии и клетки инкубируют вместе необходимое количество раз в 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Для С. золотистого это обычно между 15-90 минут. Thermanox покровные удаляются из каждой лунки и ближнего промывали в PBS для удаления одиноких бактерий. Если общий объем связанных с ними бактерий (приверженца и внутреннюю) должны быть определены количественно, покровные затем помещаются в свежем хорошо, содержащего 0,5% Тритон Х-100 в PBS. Нежный пипетирования приводит к полному лизису клетки и бактерии нумеруются серийного разведения и покрытие на агар. Если количество бактерий, которые вторглись в клетки необходимо, покровные добавляются в лунки, содержащую 500 мкл среды культуры ткани дополнена гентамицин и инкубации продолжается в течение 1 ч, что убьет всех внешних бактерий. Покровные стекла могут быть вымыты, клетки лизируются и бактерий перечисленных покрытий на агар, как описано выше. Если эксперимент требует прямой визуализации, покровные стекла могут быть зафиксированы и окрашены для света, флуоресценции и конфокальной микроскопии или подготовленные для электронной микроскопии.
Protocol
Следующий протокол будет описывать изучение эндотелиальной вторжение ячейки С. золотистый, но теоретически может быть использован для изучения сотовой вторжения любой culturable бактерии. Этапы характерных для С. золотистого и эндотелиальных клетках указаны.
1. Подготовка бактерии
- Культура С. золотистого штаммов для 4-16 ч (в зависимости от фазы роста требуется) в 10 мл сердечно-мозговой инфузии (BHI) бульоне при температуре 37 ° С на воздухе при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Эти условия роста являются специфическими для S. золотистого и, возможно, должны быть адаптированы для других бактерий.
- Вымойте бактерий три раза в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM; Invitrogen) попеременным раундов центрифугированием при комнатной температуре (5000 х г, 10 мин), удаление супернатанта культуры и ресуспендирования бактериальных гранул в эквивалентный объем DMEM. Измерьте оптическую плотность Полученную суспензию бактерий, которые затем могут быть скорректированы по мере необходимости. Для С. стафилококк, мы готовим подвески на OD 600 = 1, что соответствует ~ 10 9 КОЕ мл -1.
2. Эндотелиальная культуры клеток
- Культура эндотелиальной клеточной линии EA.hy926 1 в DMEM дополнена фетальной телячьей сыворотки (FBS; 10%) и L-глютамин (2 мМ) при 37 ° С в 5% СО 2. Кроме того, объединенных первичная пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) можно приобрести у Lonza (Базель, Швейцария) и культивировали в эндотелиальной базальной среде с добавлением 2% ЭТС, бычий экстракт мозга (включая гепарин), человеческий фактор роста эндотелия и гидрокортизон при 37 ° С в 5% CO 2 в соответствии с инструкциями производителя (Lonza). Эти условия роста являются специфическими для этих клеток и, возможно, должны быть адаптированы к другим типам клеток хозяина.
- Расти эндотелиальных клеток в колбах T75 для завершения слияния, проверено на глаз.
- Подготовка 24-луночных планшетах для вставки покровные. Изобразительное щипцы (пламя стерилизованные) необходимы для перемещения покровных, которые имеют один непрозрачный и один блестящей поверхностью. Место покровных в лунки 24-луночного планшета с непрозрачной поверхностью вверх, чтобы клетка привязанности.
- Освободить клетки T75 колбу с 3 мл трипсина-EDTA (0,25%) и добавьте к 10 мл соответствующих питательной среды.
- Добавить 500 мкл ресуспендировали клетки 24-луночного содержащие покровные Thermanox стекла. Один T75 сливной колбу клеток, при условии достаточной клеток для двух 24-луночных планшетах, в результате чего около 5 × 10 5 клеток на лунку (в 500 мкл среды).
- Инкубируйте пластин в течение 48 ч, как описано выше, и проверить 100% клетка слияния с помощью инвертированного микроскопа свет.
- Dip-покровных мыть в ФБС и добавить в новый 24-луночного содержащие 490 мкл DMEM, содержащей 10% FBS в каждую лунку.
- Для изучения роли конкретных метаболических процессов в ячейке вторжения, ингибиторы могут быть добавлены в культуре клеток 1 час до того бактерий и концентрации сохраняется в течение теста. Например, чтобы определить роль актина перестановки в S. золотистого вторжения в эндотелиальных клетках, 50 мкМ цитохалазином D могут быть добавлены, или на роль кавеол, 5 мМ метил-β-циклодекстрина могут быть добавлены.
3. Вторжение Пробирной
- Добавьте 10 мкл мыть бактерий (в результате чего примерно 2 × 10 7 КОЕ мл -1 золотистого стафилококка) в каждую лунку содержащие мыть покровное с вырожденным слоем эндотелиальных клеток в 490 мкл DMEM, содержащей 10% FBS.
- Инкубируйте 15-90 минут при температуре 37 ° С в 5% СО 2.
- Для измерения общего количества бактерий, связанных с клетками (приверженца и внутреннюю), ближнего мыть покровные три раза PBS и добавить к свежим скважин, содержащую 500 мкл 0,5% Тритон Х-100 в PBS. Для обеспечения клетки полностью лизировать и освободить всех внутренним бактерий, пипетки несколько раз, указывая кончиком пипетки непосредственно на поверхность покровным.
- Перечислять бактерий при посеве жидкой суспензии (или разведения этого в случае необходимости) на поверхности пластин АСП. Так как TX-100 будет лизировать многие грамотрицательные бактерии, сапонин может быть использован вместо 2.
- Чтобы измерить количество интернализованных бактерий, удалить супернатант культуры из каждой лунки, содержащие бактерии несвязанных и заменить 500 мкл DMEM/10% FBS дополнен 200 мкг мл -1 гентамицин. Мы обычно используют гентамицин, а не лизостафина здесь, как это дешевле и позволяет переключаться между эксперименты с использованием различных видов бактерий (например, стафилококки и лактококков) без необходимости изменения протоколе исследования.
- Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 60 минут, чтобы убить всех внеклеточных бактерий.
- Вымойте покровные 3 раза PBS,лизировать и перечислить при посеве на АСП, как описано для адгезии анализ выше.
- В некоторых случаях может оказаться предпочтительным, чтобы визуально подсчитать количество бактерий с помощью светового микроскопа. В этом случае, а также конкретные С. Вторжение золотистого ячейки, используйте лизостафина (10 мкг мл -1) вместо гентамицина физически уничтожить внеклеточных бактерий.
- Инкубируйте покровные для 20 минут при температуре 37 ° C в CO 2 в растворе лизостафина, затем смойте и зафиксировать Cytopath (Cellpath).
- Потоп покровные кристаллическим фиолетовым (0,5%, в / о) за 5 мин.
- Dip-промыть в воде, воздушно-сухой и смонтировать на стеклах. Число бактерий в мм 2 вырожденных эндотелиальных клеток может быть определена количественно с помощью светового микроскопа.
4. Представитель Результаты:
Выражение фибронектина связывающих белков (FnBPA и FnBPB) на поверхности S. золотистого дает возможность вторгнуться в эндотелиальных клетках. Последние работы пересмотрел фибронектин-связывающий домен FnBPA 3. Дикого типа (WT) С. золотистого 8325,4 вторгается в эндотелиальных клетках с высокой эффективностью, в то время как напряжение отсутствует FnBPA и B (Δ FNB) показали значительно снижение уровня интернализации (рис. 1А). Комплементации мутанта с плазмидой FNB кодирования минус фибронектин-связывающий домен (pFnR0) не способствовало вторжение (рис. 1А). С другой стороны, дополняемости мутант с плазмидой, кодирующей всей FNB гена (pFnBA4) восстановил вторжение WT уровня (рис. 1А).
Роль FnBPA в эндотелиальных вторжения ячейка может быть также продемонстрированы с использованием гетерологичных Лактис хост выражение Lactococcus. Выражение плазмиды в кодировке FnBPA в L. Лактис (pRM9 9) не значительно повысить сцепление с эндотелиальных клеток по сравнению с бактериями выражения не FnBPA (CTL) (открыты бары, рисунок 1В). С другой стороны, FnBPA экспрессирующих Л. Лактис вторглись в эндотелиальных клетках при значительно более высоких уровнях, чем не выразив напряжение (закрытые бары, рисунок 1В).
Эксперименты проводились четыре раза в двух экземплярах и среднее ± стандартное отклонение представлена. * Представляют данные, которые статистически значимо отличается (р = <0,05) от WT или CTL ценностей.
Рисунок 1. Вторжение EA. Hy926 эндотелиальных клеток С. стафилококк () или L. Лактис (B).
Discussion
Анализа мы описываем базируется на анализе гентамицин защиты, которая широко используется для изучения вторжения в клетки хозяина бактериями. Наблюдения за неспособности гентамицин и другие антибиотики, чтобы убить внутриклеточных бактерий были использованы в начале исследования вторжения в клетки хозяина бактериями 4-8. Использование 24, 48 или даже 96-луночных позволяет генерировать большое количество количественные, воспроизводимые данные в короткие сроки и при относительно низких затратах. Анализа является также привлекательным, поскольку он не требует специального оборудования, она может быть адаптирована для работы с различными бактериями и клетками, и может быть использован для изучения роли как бактериальные и клеточные процессы хост в вторжением 9. Действительно, начиная с самых ранних экспериментов, анализа гентамицин защита была широко используются для измерения вторжения клетки-хозяина целым рядом различных бактерий или даже комбинации бактерий 10,11. Хотя основные принципы те же, многие тонкие изменения в метод не поступало. В этой статье мы описали нашу версию и указал, где изменения могут быть необходимы для других бактерий или клеток хозяина. При проектировании эксперимента по измерению клетки-хозяина вторжения с использованием этого подхода Есть ряд важных моментов, чтобы рассмотреть:
Бактериальные чувствительность к гентамицину. Это может показаться очевидным, но важно, чтобы убедиться, что бактерия изучается подвержен гентамицин в концентрации, температуры и с течением времени продолжительность будет использоваться. В случае нечувствительности, это может быть возможно использование других антибиотиков 5. Альтернативный подход может заключаться в использовании литических ферментов (лизостафина, mutanolysin, лизоцим) 12.
Инкубация и прививочный материал. При выполнении этого теста в первый раз, важно, чтобы установить оптимальное время инкубации и бактериальных посевной будет использоваться. Таким образом, первые эксперименты должны изучить как адгезия и инвазия в течение долгого времени (5 мин до 6 ч). Важно также, чтобы оценить, как вторжение зависит от множественности инфекции (МВД, число бактерий в клетку). В общем, лучше всего использовать наименьшее количество бактерий возможно, поскольку это позволит сократить ущерб культуре клеток. Важные различия между штаммами могут быть упущены, если длительного периода инкубации или большие инокулята используются 9,13.
Сотовая повреждения. Важно, чтобы вымыть бактерий до использования. Тем не менее, повреждения клеток не ограничивается токсина. Бактериальная инвазия, индукции апоптоза и нарушению нормальной клеточной функции все это может вызвать повреждение клеток. Это может привести к проникновению гентамицин внутрь клетки, убивая бактерии и внутренним создавая впечатление, что вторжения не произошло 14.
Инкубационный условиях. Температуры и состава питательной среды может иметь значительное влияние на вторжение. Например, вторжение в клетках HeLa по Streptococcus pyogenes, зависит от наличия растворимого фибронектина, который обычно присутствует в сыворотке крови 15. Другим аспектом является рост бактерий в питательной среде в ходе эксперимента.
Культура и количественное определение внутриклеточных бактерий. Хотя TX-100 не может убить внутриклеточных бактерий, может подавлять их рост. Таким образом, важно проверить бактериальных репликации на твердой среде в присутствии моющего средства. Если затронуты, то можно использовать более низкие концентрации моющего средства или использовать альтернативные, такие как сапонины. Благо анализа гентамицин защиты по кристаллу окрашивания фиолетовый и микроскопии анализа является то, что он менее трудоемкий, и это позволяет обнаружения и дифференциации субпопуляций внутренним бактерий. Например, С. золотистого можно производить либо нормального типа колонии (НКТ) или небольшой вариант колонии (SCV) 16, которые не были бы различимы с помощью микроскопии отдельных бактериальных клеток. Благо кристалл фиолетового окрашивания и микроскопии анализа за анализ защиты гентамицин, является клеточная слипания можно объяснить и что внутриклеточные бактерии, которые входят в "жизнеспособной, но не culturable" государство будет обнаружен 17.
Изучение роли процессов клетки-хозяина в бактериальной инвазии. Многие исследования использовали ингибиторы клетки-хозяина функции, такие как цитохалазином D, который препятствует актина перестановки. Такие исследования могут также включать антитела, направленные на поверхности клеток рецепторы и миРНК нокдаун специфических генов 18. Это жизненно важно обеспечить, чтобы эти процедуры не влияют на жизнеспособность или вложения культивируемых клеток или оказывать токсическое действие на бактерии.
Будущие направления:
ontent "> Поскольку этот анализ обычно выполняется в мульти-луночных культуре клеток, теоретически возможно, чтобы приспособить его к высокопроизводительного скрининга операция, которая может включать в себя изучение библиотек потенциальных клеточной функции ингибиторы, антибактериальных средств или антибиотики, разработанные с целью внутриклеточных бактерий. Кроме того, такой подход может быть использован для скрининга мутантов библиотек для идентификации генов, участвующих в адгезии, инвазии или внутриклеточного выживания. В некоторых случаях может быть желательно включить силы сдвига (течения) в модельной системе, например, при моделировании эндотелия, чтобы более точно имитировать в естественных условиях окружающей среды. Текущие успехи в разработке и производстве поток клеток и микрожидкостных систем культуры клеток обеспечивает возможность использования анализа гентамицин защиты в принимающей возбудителя моделей, которые включают поперечных сил.Таким образом, протокол, описанный здесь, основан на аналогичных подходов, используемых в течение многих лет. Она широко применяется на многих типах культивируемых клеток и видов бактерий и может генерировать большие объемы данных, быстро и при относительно небольших затратах.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Wellcome Trust (WT 0795880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
