Summary
Мы опишем протокол для микротехнологий градиента генерирующих микрожидкостных устройств, которые могут генерировать пространственные и временные градиенты в четко определенных микроокружения. При таком подходе, градиент генерирующих микрожидкостных устройство может быть использовано для изучения направлены миграции клеток, эмбриогенез, заживление ран и рака метастазы.
Abstract
Изготовления и эксплуатации градиент генерирующих микрожидкостных устройств для изучения сотовой поведение описано. Микрожидкостных платформа позволяет экспериментальный инструмент, потому что она может точно управлять потоками жидкости, обеспечивают высокую пропускную экспериментов, а также генерировать стабильный растворимый градиенты концентрации. По сравнению с обычными генераторами градиент, поли (диметилсилоксана) (PDMS)-основанной микрожидкостных устройств может генерировать стабильный градиент концентрации факторов роста, с четко определенными профилями. Здесь, мы разработали простой градиент генерирующих микрожидкостных устройств с тремя раздельными входами. Три микроканалов объединены в один микроканальных для создания градиентов концентрации. Стабильность и форму градиенты фактор роста были подтверждены флуоресцеина isothyiocyanate (FITC)-декстрана с молекулярной массой похож на эпидермальный фактор роста (EGF). Используя этот микрожидкостных устройств, мы показали, что фибробласты подвергается градиентов концентрации ЭФР мигрировал в сторону более высоких концентраций. Направленной ориентации миграции клеток и моторику мигрирующих клеток были количественно оценены ячейки отслеживания анализа. Таким образом, этот градиент генерирующих микрожидкостных устройство может оказаться полезным для изучения и анализа поведения мигрирующих клеток.
Protocol
А. микротехнологий градиента генерирующих микрожидкостных устройств
- Пластины кремния обрабатывают реактивные кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
- Отрицательные фоторезиста (ГУ-8 50, Microchem, MA) является спин-покрытием при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин на пластины кремния.
- Пластины мягкой выпекают при температуре 65 ° С в течение 10 мин, а затем при 95 ° С в течение 30 мин на плите.
- Пластины под действием УФ света (200 Вт) в течение 3 мин через маску прозрачности с минимальным размером особенностью 30 мкм.
- Пластины сообщение выпекают при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а при 95 ° С в течение 10 мин.
- Si мастер формы с толщиной 100 мкм каналов разработан с использованием SU-8 фоторезиста разработчика.
- Пластины содержащей микроканалов помещается в Петри-блюдо.
- Поли (диметилсилоксана) (PDMS) (Sylgard 184) формы изготавливаются путем смешивания эластомера силикона и отвердителя (10:1).
- Смесь PDMS выливают на плесень мастер Si.
- Плесень Si мастер находится на вакуумном эксикаторе, чтобы удалить пузырьки в течение 10 мин.
- PDMS отверждается при температуре 70 ° С в течение 1 ~ 2 часа.
- PDMS Формы снимают с формы мастер Si.
Б. Экспериментальная установка
- Сотовые вход, выход, и вливая губах PDMS основе микрожидкостных устройств пробиваются с помощью резкого перфораторы.
- Устройство и стекло (2 × 3 дюйма) необратимо связанных с реактивной кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
- Полиэтиленовые трубы (ПЭ 20, Becton Dickinon, MD) вставляется в вливая губах микрожидкостных устройств, а затем подключен к шприцевой насос.
- Fluorescein изотиоцианат (FITC)-декстран (MW = 10kD, 10 мкм, Sigma) и буфером (PBS, Invitrogen, Калифорния) переплетаются в микрожидкостных устройств подтверждением стабильного градиентов внутри жидкостных устройств.
- Внеклеточного матрикса (ECM) (например, фибронектин) покрыты внутри микрожидкостных устройств в течение 1 часа в инкубатор (37 ° С).
- NIH 3T3 фибробласты являются трипсином и диссоциирован.
- Расхождение между клетками загружаются в микрожидкостных устройств (800 мкм в ширину) при плотности клеток 2 × 10 6 клеток / мл.
- 2 мл СМИ и 50 нг / мл эпидермального фактора роста (ЭФР) придают в микрожидкостных устройств для генерации растворимые градиентов используйте шприцевой насос (0,05 мкл / мин).
- Клетки в режиме реального времени мониторинг каждые 5 минут с помощью инвертированного микроскопа (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клетки подвергаются стабильный градиент концентрации ЭФР в микрожидкостных устройств мигрировал в сторону более высоких концентраций. Направленной ориентации клеточной миграции, хемотаксиса индекс, моторику мигрирующих клеток были исследованы по мобильному отслеживания анализа. Таким образом, этот градиент генерирующих микрожидкостных платформы могут быть полезны для изучения рака метастазы, эмбриогенеза, и аксон руководства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
