Summary
हम ढाल पैदा microfluidic युक्ति है कि अच्छी तरह से परिभाषित microenvironment में स्थानिक और लौकिक gradients उत्पन्न कर सकते हैं microfabrication के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस दृष्टिकोण में, ढाल पैदा microfluidic युक्ति करने के लिए निर्देशित सेल प्रवास, embryogenesis, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन किया जा सकता.
Abstract
निर्माण और सेलुलर व्यवहार के अध्ययन के लिए एक ढाल पैदा microfluidic डिवाइस के आपरेशन में वर्णित है. एक microfluidic मंच एक समर्थकारी प्रायोगिक उपकरण है, क्योंकि यह ठीक द्रव प्रवाह में हेरफेर कर सकते हैं उच्च throughput प्रयोगों को सक्षम करने के लिए, और स्थिर घुलनशील एकाग्रता gradients उत्पन्न. पारंपरिक ढाल जनरेटर (dimethylsiloxane) पाली (PDMS) की तुलना में आधारित microfluidic उपकरणों प्रोफाइल के साथ अच्छी तरह से परिभाषित वृद्धि कारकों की स्थिर एकाग्रता gradients उत्पन्न कर सकते हैं. यहाँ, हम तीन अलग inlets के साथ सरल ढाल पैदा microfluidic उपकरणों को विकसित किया है. तीन microchannels एक microchannel में संयुक्त एकाग्रता gradients उत्पन्न. epidermal वृद्धि कारक (EGF) के लिए इसी तरह की एक आणविक वजन के साथ स्थिरता और वृद्धि कारक gradients के आकार fluorescein (FITC) isothyiocyanate-dextran द्वारा पुष्टि की गई. इस microfluidic युक्ति का प्रयोग, हमने दिखा दिया कि EGF की एकाग्रता gradients को उजागर fibroblasts उच्च सांद्रता की ओर चले गए. सेल और पलायन कोशिकाओं के प्रवास गतिशीलता के दिशात्मक उन्मुखीकरण मात्रात्मक विश्लेषण ट्रैकिंग सेल द्वारा मूल्यांकन किया गया. इस प्रकार, इस ढाल पैदा microfluidic युक्ति पलायन कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन और विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है.
Protocol
ढाल पैदा microfluidic डिवाइस के ए Microfabrication
- सी वफ़र प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्लाज्मा (30W, Harrick वैज्ञानिक में 5 मिनट, NY) के साथ इलाज किया जाता है.
- नकारात्मक photoresist (एसयू 8 50, Microchem, एमए) एक सी वफ़र पर 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर स्पिन लिपटे है.
- वफ़र नरम है 65 में पकाया ° 10 और 95 पर बाद में मिनट के लिए सी ° सी एक hotplate पर 30 मिनट के लिए.
- वफ़र 30 सुक्ष्ममापी की एक न्यूनतम सुविधा आकार के साथ एक पारदर्शिता मुखौटा के माध्यम से 3 मिनट के लिए यूवी प्रकाश (200W) के संपर्क में है.
- वफ़र 65 में पकाया पोस्ट ° 1 मिनट के लिए और 95 डिग्री सेल्सियस सी 10 मिनट के लिए.
- सी 100 सुक्ष्ममापी मोटी चैनल के साथ मास्टर मोल्ड SU-8 photoresist डेवलपर का उपयोग करने के लिए विकसित की है.
- वफ़र microchannels युक्त एक पेट्री डिश में रखा गया है.
- (Dimethylsiloxane) पाली (PDMS) (184 Sylgard) molds मिश्रण सिलिकॉन elastomer और इलाज एजेंट (10:01 अनुपात) के द्वारा गढ़े हैं.
- PDMS मिश्रण सी मास्टर मोल्ड पर डाल दिया है.
- सी मास्टर मोल्ड एक निर्वात desiccator पर 10 मिनट के लिए बुलबुले को दूर रखा गया है.
- PDMS 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 ~ 2 घंटे के लिए ठीक है.
- PDMS molds के बंद सी मास्टर मोल्ड से खुली हैं.
बी प्रायोगिक सेटअप
- PDMS आधारित microfluidic युक्ति के सेल इनलेट, आउटलेट, और infusing inlets तेज punchers का उपयोग करके छिद्रित हैं.
- एक डिवाइस और एक गिलास स्लाइड (2 × 3 इंच) अचल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्लाज्मा (30W, Harrick वैज्ञानिक में 5 मिनट, एनवाई) द्वारा बंधुआ रहे हैं.
- Polyethylene टयूबिंग (20 पीई, Becton Dickinon, एमडी) microfluidic डिवाइस के infusing inlets में डाला जाता है और बाद में एक सिरिंज पंप से जुड़ा है.
- Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) dextran (मेगावाट 10kD = 10 सुक्ष्ममापी सिग्मा) और बफर (Pbs, Invitrogen, सीए) microfluidic डिवाइस में संचार कर रहे हैं fluidic उपकरण के अंदर स्थिर gradients की पुष्टि.
- कोशिकी मैट्रिक्स (ईसीएम) (यानी, fibronectin) microfluidic युक्ति के अंदर इनक्यूबेटर में 1 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए लेपित है.
- एनआईएच 3T3 fibroblast कोशिकाओं trypsinized और अलग कर रहे हैं.
- Dissociated कोशिकाओं microfluidic डिवाइस (800 सुक्ष्ममापी विस्तृत) में 2 के सेल घनत्व × 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर लोड कर रहे हैं.
- 2 मिलीलीटर मीडिया और 50 एनजी / मिलीलीटर epidermal वृद्धि कारक (EGF) एक microfluidic डिवाइस में घुलनशील एक सिरिंज पंप (0.05 μl / मिनट) का उपयोग gradients पैदा करने के लिए संचार होता है.
- कक्ष वास्तविक समय एक औंधा माइक्रोस्कोप (Nikon ते 2000) का उपयोग करके हर 5 मिनट निगरानी कर रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कक्ष एक microfluidic डिवाइस में उच्च सांद्रता ओर माइग्रेट EGF के स्थिर एकाग्रता gradients के लिए अवगत कराया. सेल प्रवास, chemotactic सूचकांक, पलायन कोशिकाओं की गतिशीलता के दिशात्मक उन्मुखीकरण सेल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा जांच की गई. इसलिए, इस ढाल पैदा microfluidic मंच कैंसर मेटास्टेसिस embryogenesis और अक्षतंतु मार्गदर्शन के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
