Summary
Nous décrivons un protocole pour la microfabrication de l'appareil de gradient générant microfluidique qui peuvent générer des gradients spatiaux et temporels bien définis microenvironnement. Dans cette approche, l'appareil de gradient générant microfluidiques peuvent être utilisées pour étudier la migration cellulaire dirigée, l'embryogenèse, la cicatrisation, et les métastases du cancer.
Abstract
La fabrication et le fonctionnement d'un dispositif de gradient générant microfluidique pour étudier le comportement cellulaire est décrite. Une plate-forme microfluidique est un outil permettant d'expérimentation, parce qu'il peut manipuler précisément les flux de fluide, permettant à haut débit des expériences, et de générer des gradients de concentration stables solubles. Comparé à des générateurs de gradient conventionnel, le poly (diméthylsiloxane) (PDMS) à base de dispositifs microfluidiques peuvent générer des gradients de concentration stable de facteurs de croissance avec des profils bien définis. Ici, nous avons développé simples gradient générant des dispositifs microfluidiques avec trois entrées séparées. Trois microcanaux combinés en un microcanal de générer des gradients de concentration. La stabilité et la forme des gradients de facteur de croissance ont été confirmées par la fluorescéine isothyiocyanate (FITC)-dextrane avec un poids moléculaire similaire au facteur de croissance épidermique (EGF). L'utilisation de ce dispositif microfluidique, nous avons démontré que les fibroblastes exposés à des gradients de concentration d'EGF migré vers des concentrations plus élevées. L'orientation directionnelle de la migration cellulaire et la motilité des cellules en migration ont été quantitativement évaluée par l'analyse des cellules de suivi. Ainsi, ce dispositif de gradient générant microfluidique pourrait être utile pour étudier et analyser le comportement des cellules en migration.
Protocol
A. microfabrication de l'appareil de gradient générant microfluidique
- La plaquette de Si est traitée avec du plasma d'oxygène réactif (5 min à 30W, Harrick scientifique, NY).
- Photoresist négatif (SU-8 50, Microchem, MA) est spin-couché à 1000 rpm pendant 1 min sur un wafer de silicium.
- La plaquette est douce cuit à 65 ° C pendant 10 min et ensuite à 95 ° C pendant 30 min sur une plaque chauffante.
- La plaquette est exposée à la lumière UV (200W) pendant 3 min à travers un masque de transparence avec une taille minimum de 30 um.
- La plaquette est post cuit à 65 ° C pendant 1 min et à 95 ° C pendant 10 min.
- Si maître de moule avec les canaux 100 um d'épaisseur est développé en utilisant SU-8 développeur résine photosensible.
- La plaquette contenant des microcanaux est placé dans une boîte de Petri.
- Moules de poly (diméthylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) sont fabriqués par élastomère de silicone de mélange et de durcisseur (10:1).
- Le mélange PDMS est versé sur le moule maître de silicium.
- Le moule maître Si est placée sur un dessiccateur à vide pour enlever les bulles pendant 10 min.
- PDMS est guéri à 70 ° C pendant 1 ~ 2 heures.
- Moules en PDMS sont décollée du moule maître de silicium.
B. Montage expérimental
- Criques entrée de la cellule, de sortie, et insufflant de l'appareil à base de PDMS microfluidiques sont perforées en utilisant perforeuses forte.
- Un dispositif et une lame de verre (2 x 3 pouces) sont irrémédiablement liés par le plasma d'oxygène réactif (5 min à 30W, Harrick scientifique, NY).
- Tube en polyéthylène (PE 20, Becton Dickinon, MD) est inséré dans les criques infusant du dispositif microfluidique et ensuite reliée à une pompe seringue.
- Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (PM = 10kD, 10 uM, Sigma) et le tampon (PBS, Invitrogen, CA) sont infusés dans le dispositif microfluidique pour confirmer gradients stables à l'intérieur du dispositif fluidique.
- Matrice extracellulaire (MEC) (ie, la fibronectine) est recouvert à l'intérieur du dispositif microfluidique pendant 1 heure dans un incubateur (37 ° C).
- Les cellules NIH 3T3 fibroblastes sont trypsinisées et dissociés.
- Les cellules dissociées sont chargés dans le dispositif microfluidique (800 um de large) à la densité de cellules de 2 × 10 6 cellules / ml.
- 2 médias ml et 50 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) est perfusé dans un dispositif microfluidique pour générer des gradients solubles à l'aide d'une seringue électrique (0,05 l / min).
- Les cellules sont surveillées en temps réel toutes les 5 min en utilisant un microscope inversé (Nikon TE 2000).
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Discussion
Les cellules exposées à des gradients de concentration stable de l'EGF dans un dispositif microfluidique migré vers des concentrations plus élevées. L'orientation directionnelle de la migration cellulaire, l'index chimiotactique, la motilité des cellules en migration ont été étudiés par l'analyse des cellules de suivi. Par conséquent, cette plate-forme de gradient générant microfluidique pourrait être utile pour étudier les métastases du cancer, l'embryogenèse, et le guidage axonal.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
