Summary
イモリでは、レンズの絞り色素上皮細胞（IPEs）の分化転換によって背側の虹彩から常に再生成されます。ここでは、イモリの眼への文化背側と腹イモリIPE細胞とその移植する手順を説明します。移植細胞は、組織切片と免疫組織化学によって研究されています。
Abstract
イモリやアホロートルのようなサンショウウオは、四肢、脊髄、眼、脳、心臓、顎1と尾など、その失われた身体の部分の多くを再生成する能力を有する。具体的には、イモリは、そのレンズの再生能力のための固有のものです。レンズの取り外し時には、背側の虹彩のIPE細胞は水晶体細胞への分化形質転換すると最終的に約月に2,3の新しいレンズを形成する。再生のこのプロパティは、腹側の虹彩細胞で展示されることはありません。虹彩の細胞の再生の可能性は 、in vitro培養IPE細胞での移植を行うことによって調べることができます。培養には、背側と腹側の虹彩細胞が最初に目から絶縁されており、2週間の期間（ 図1）に別々に培養した。これらの培養細胞はreaggregatedとイモリの目に戻って注入される。過去の研究では、腹骨材は4,5（ 図2）このように生体内でのプロセスにおいて 、recapitulating、レンズを形成しないのに対し、背側再集合させるが、そのレンズ形成能力を維持することが示されている。背側と腹側の虹彩細胞の再生の可能性を決定するこのシステムは、レンズの再生に関与する遺伝子やタンパク質の役割を研究するに非常に便利です。
Protocol
1。アイリスの細胞培養
- 7イモリ（PBSで製造した3 - アミノ安息香酸、メタンスルホン酸エチル0.1％麻酔）とカルシウムマグネシウムフリーハンクス溶液（CMF）の位置から眼球を収集する。
- 手袋を変更し、組織培養フードで働いています。
- 3秒間Lugol's - EtOH中で目のボールを滅菌する。
- CMFで2回洗浄する。
- ハンクスに目を移し、解剖を始める。
- アイリス - 角膜の複合体を摘出し、神経網膜を削除します。
- ハンクスの新しい皿に複合体を移す。
- 背側と腹側半分に＃15メス、別々の複合体を使用する。
- アイリスの断片を（最初の腹側）を取り外し、1 mlのL - 15を含む皿の場所。
- 15％（150 UL）ディスパーゼの量を（7.5単位/ mlの濃度）を追加します。
- 27 2時間° C（パラフィルムでラップ皿）でインキュベートする。
- ストロマ（27において配置トリプシン溶液° C）からIPE細胞を分離する。
- 1.5 mlチューブにIPE細胞を回収。
- 2分間RT（室温）で1000回転で遠心分離、上清を取り除く。
- 1ミリリットルハンクスと2分間、室温で1000rpmで遠心機で洗って、上清を取り除く。
- 1ミリリットルトリプシン溶液を追加し、27℃で2時間インキュベート℃に
- 2分間、室温で1000rpmで遠心分離は、トリプシンを削除します。
- 2分間1000rpmで遠心分離、洗浄するために1 mlのL - 15を追加。
- ゆっくりと上下に800 ulのL - 15、ピペット〜10回（12倍以上の付着を減少させる）を追加します。
- プレート27で24ウェルコラーゲンコーティングプレートとインキュベート上IPE細胞℃で2週間（通常は、4背、4腹の井戸は7イモリから得られる）のため。
- この段階で細胞が遺伝子のトランスフェクションまたは誘引し、又はレンズの再生を妨げることでその役割を決定する要因との治療に適している。
2。アイリスの細胞の凝集
- 虹彩の細胞を含むプレートに400μlの培地、優しくスワールにディスパーゼ溶液を20μlの追加。
- 27℃で一晩培養する。
- 上下に優しくピペット細胞を取り除くために、
- エッペンドルフチューブ、室温で1000rpmで2分間スピンに場所細胞。
- 1ミリリットルの完全なL - 15室温で1000rpmで、スピン2分を追加することによって培地と洗浄液を除去、培地を取り除く。
- 集約あたりの2000-7000の細胞を使用してください。各チューブに集約あたり200μlのL - 15を追加。
- 新しいエッペンドルフチューブに分割細胞（200μl）を。
- 室温で2分間、1000rpmでスピン。
- 27で48時間インキュベート℃に
3。まとめたところ細胞の移植
- イモリの目の角膜のスリットを作り、レンズを取り外します。
- レンズを除去した後、ちょうど目の腹側の角膜組織の下にIPE細胞の集合体を配置。
- イモリは、それらがレンズを再生成できるようにするか月間保持されます。
4。イモリの目の埋め込み
- アグリゲートを移植したイモリの目を削除し、リン酸塩に置くには、緩衝食塩水（PBS）。
- 少なくとも4時間または一晩4℃で4％パラホルムアルデヒドで固定してください。
- 30分間、PBS、4℃で洗浄する。
- 4℃、30分：0.85％生理食塩水でそれを扱う。
- 15分間RT：生理食塩水/エタノール（1:1）で洗浄する。
- 70％エタノールで洗う：RT、15分。一度それを繰り返します。
- 85％エタノールで洗浄し、室温にて95％エタノール、30分ごとに
- 100％エタノールで洗う：RT、30分。一度それを繰り返します。
- 4℃または継続。
- 100％キシレンで洗浄する：RT、30分。一度それを繰り返します。
- 60 ° C、45分：キシレン/パラフィン（1:1）で扱います。
- 60 ° C、20分：100％パラフィンで処理。それをあと2回繰り返します。
- 金型を埋め込むに埋め込む。
5。セクショニング
- ミクロトームを使用して埋め込まれた目の15μmの切片を作製します。
- ゼラチンコートしたスライド上に目のセクションを配置し、暖かくスライド上に置いたまま。
6。染色
- 10分間、キシレンでスライドを置きます。もう一度それを繰り返します。
- の水和物：100％、95％、80％、70％、1分ごとに30％エタノール
- 分間超純水ですすいでください。
- 15分間PBSで洗浄する。
- 15分間PBST（0.2％PBSでトリトン- X 100）で洗浄する。
- 15分間PBSで洗浄する。
- 時間溶液（10％ヤギ二次抗体）をブロッキングの場所。
- 一晩一次抗体の場所。
- 15分間PBSで一次抗体を洗浄してください。
- 15分間PBSTで洗浄する。
- 15分間PBSで洗浄する。
- 暗所で2時間二次抗体の代わりに（PBSで1:100希釈）。
- 15分ごとにしてからマウントするためにPBS、PBST、そしてPBSで洗浄する。
- 蛍光顕微鏡下でスライドを観察。
7。代表的な結果：
培養イモリIRのこの手順細胞は背側と腹側IPE細胞の再生の可能性を研究するために利用されているです。また、イモリの眼のレンズの再生メカニズムに向けて貢献する特定の遺伝子を研究することも可能です。細胞を2週間培養されているとき（ 図1）これらはレンズの再生でその機能を調べるために遺伝子によってトランスフェクトすることができます。特に興味深いのは、腹側の絞りを誘発するかもしれない遺伝子があります。腹側アイリスの細胞がレンズ（ 図2）候補遺伝子の誘導機能に分化形質転換することができないので研究することができる。過去には、このテクニックを使用して我々は6 - 3はオーバーレチノイン酸のレンズの誘導の存在下で発現されたときに腹側絞り6から観察されたことが示されている。 図3に我々は腹側アイリスの集合体は背側アイリス（矢印）からホストのレンズよりも差が十分に成長し、分化したレンズ（矢印）、を生じさせたことがわかります。
図1。 ）背虹彩色素上皮細胞は2週間の期間のためにin vitroで培養した。 b）の腹側の虹彩色素上皮細胞は2週間の期間のためにin vitroで培養した。色素沈着は、背側と腹側の両方虹彩の細胞でこの段階に続くことに注意してください。
図2。培養IPE細胞の再生能力。背IPE細胞の集合体（矢頭）からA）レンズの誘導。背アイリス（矢印）、ディからレンズの誘導ホスト：背アイリス、viの：腹側アイリス、ル：レンズ上皮、LF：レンズ繊維。腹IPE細胞の集合体（矢頭）からレンズの誘導のb）の欠如。背アイリス（矢印）からホストのレンズの誘導。
図3。腹骨材からのレンズの誘導は、6 - 3をトランスフェクトし、レチノイン酸で処理した。背アイリス（矢印）からホストのレンズの誘導。腹骨材（矢頭）からレンズの誘導。
Discussion
このプロトコルは、イモリのレンズ再生のメカニズムを研究するためのin vitroの系を確立しています。凝集するので（どちらか背側または腹側は誠実には再生、この手法の間に生体内での行動でイモリの遺伝子導入に必要と関数のゲインだけでなく、機能の実験7,8,9の損失のために使用することができる途方もない労力を軽減することができる従ってください。また、 、全体としての集合体または虹彩は容易に増殖因子で処理し、このプロトコルで説明されているようにその効果を調べることができます。例えば、BMP経路の役割はこのテクニック6を使用して検討されている。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、PATにNIHの助成金Ey10540によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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