Summary
En Tritón, la lente siempre se regenera a partir de la dorsal del iris por la transdiferenciación de las células epiteliales pigmentadas de iris (IPE). Aquí se describe un procedimiento para cultivar células tritón dorsal y ventral IPE y su implantación en el ojo de tritón. Las células implantadas se estudian por el corte de tejidos e inmunohistoquímica.
Abstract
Salamandras y tritones como ajolote poseen la capacidad de regenerar muchas de sus partes del cuerpo perdido, como las extremidades, la cola con la médula espinal, ojos, cerebro, corazón, la mandíbula 1. En concreto, los tritones son únicos por su capacidad de regeneración de la lente. Tras la eliminación de lentes, las células de la IPE dorsal iris transdiferenciarse a las células del cristalino y, finalmente, formar un nuevo objetivo dentro de un mes 2,3. Esta propiedad de la regeneración no es exhibida por la ventral las células del iris. El potencial de regeneración de las células del iris puede ser estudiado por lo que los trasplantes de la in vitro IPE células cultivadas. Para el cultivo, las células del iris dorsal y ventral se aisló por primera vez a los ojos y cultivados por separado durante un periodo de 2 semanas (Figura 1). Estas células cultivadas se reaggregated y se implanta de nuevo al ojo de tritón. Estudios anteriores han demostrado que el reaggregate dorsal mantiene su capacidad de formación de la lente, mientras que el agregado ventral no forma una lente, recapitulando, por lo tanto el proceso en vivo (Figura 2) 4,5. Este sistema de determinación del potencial de regeneración de las células del iris dorsal y ventral es muy útil para estudiar el papel de los genes y las proteínas implicadas en la regeneración de la lente.
Protocol
1. Iris cultivo celular
- Recoger los globos oculares de 7 tritones (anestesiados en el 0,1% el 3-aminobenzoato de ácido metano sulfónico preparado en PBS) y el lugar en el calcio, magnesio libre Hanks solución (CMF).
- Cambie los guantes y trabajar en la campana de cultivo de tejidos.
- Esterilizar globos oculares en Lugol-EtOH durante 3 segundos.
- Lavar dos veces en el CMF.
- La transferencia de los ojos de Hanks y comenzar la disección.
- Diseccionar iris-corneal complejo y eliminar la retina neural.
- La transferencia de los complejos en un nuevo plato de Hanks.
- # 15 complejos utilizando bisturí, separada en dos mitades dorsal y ventral.
- Extraer los fragmentos del iris (ventral primero) y colóquelo en un recipiente que contenga 1 ml L-15.
- Añadir un 15% (150 ul) de volumen de dispasa (7,5 unidades / ml de concentración).
- Se incuba a 27 ° C durante 2 horas (plato envolver con parafilm).
- Aislar las células del estroma de IPE (solución Colocar tripsina a 27 ° C).
- Recoger las células IPE en un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente (temperatura ambiente) durante 2 minutos, retire el sobrenadante.
- Lavar con 1 ml Hanks y centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos, retire el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de solución de tripsina, se incuba durante 2 horas a 27 ° C.
- Centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos, retire la tripsina.
- Añadir 1 ml L-15 para lavar, centrifugar a 1000 rpm durante 2 minutos.
- Añadir 800 ul L-15, pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo ~ 10 veces (más de 12 veces se reduce la adherencia).
- Placa de las células IPE en un plato de colágeno 24 pozos cubierto y se incuba a 27 ° C durante 2 semanas (por lo general, cuatro dorsal y ventral 4 pozos se obtienen a partir de 7 tritones).
- En esta etapa las células son adecuados para la transfección de genes o el tratamiento con los factores para determinar su papel en la inducción o interferir con la regeneración de la lente.
2. La agregación de células Iris
- A las placas que contienen las células del iris añadir 20μl de solución dispasa a 400 l medio, revuelva suavemente.
- Incubar las placas a 27 ° C durante la noche.
- Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células
- Células de lugar en el tubo Eppendorf y girar durante 2 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente.
- Quitar y lavar medio mediante la adición de 1 ml L-15 completa, spin 2 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente, quite medio.
- Use 2000-7000 células por agregada. Añadir 200 ul L-15 por el agregado en cada tubo.
- Las células se dividen (200 l) en los nuevos tubos eppendorf.
- Giran a 1000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente.
- Incubar durante 48 horas a 27 ° C.
3. La implantación de células Aggregrated
- Haga un corte en la córnea del ojo de tritón y quitar la lente.
- Después de extracción del cristalino, coloque el agregado de células IPE justo por debajo del tejido de la córnea en la parte ventral del ojo.
- Los tritones se mantienen durante un mes para dejar que la regeneración del lente.
4. Incorporación de los ojos Newt
- Quitar los ojos de tritón implantado con el agregado y lo coloca en tampón fosfato salino (PBS).
- Fijar en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante al menos 4 horas o toda la noche.
- Se lavan con PBS, 4 ° C durante 30 minutos.
- Tratar con 0,85% de solución salina: 4 ° C, 30 minutos.
- De lavado en solución salina / etanol (1:1): RT durante 15 minutos.
- De lavado en etanol al 70%: RT, de 15 minutos. Repetir una vez.
- Lave en el 85% de etanol y 95% de etanol a temperatura ambiente, 30 minutos cada uno
- De lavado en etanol al 100%: RT, de 30 minutos. Repetir una vez.
- Almacenar a 4 ° C o continuar.
- Lave en xileno al 100%: RT, de 30 minutos. Repetir una vez.
- Tratar con xileno / parafina (1:1): 60 ° C, 45 minutos.
- Tratar con el 100% de parafina: 60 ° C, 20 minutos. Repítelo dos veces más.
- Integrar al incorporar los moldes.
5. Seccionamiento
- Prepare 15 secciones micras de los ojos incrustados utilizando un microtomo.
- Coloque las secciones de los ojos en un portaobjetos recubiertos de gelatina y se deja en una lámina caliente.
6. Tinción
- Coloque los portaobjetos en xileno durante 10 minutos. Repetir una vez más.
- De hidratos en: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% de etanol durante 1 minuto cada uno
- Enjuague con agua DI por un minuto.
- Se lavan con PBS durante 15 minutos.
- Lave en PBST (0,2% Triton X-100 en PBS) durante 15 minutos.
- Se lavan con PBS durante 15 minutos.
- Lugar en solución de bloqueo (10% anticuerpo de cabra secundaria) durante una hora.
- Lugar en el anticuerpo primario durante la noche.
- Lavar el anticuerpo primario en PBS durante 15 minutos.
- Lave en PBST durante 15 minutos.
- Se lavan con PBS durante 15 minutos.
- Lugar en el anticuerpo secundario durante 2 horas en la oscuridad (dilución 1:100 en PBS).
- Se lavan con PBS, PBST, y PBS durante 15 minutos cada uno y luego montar.
- Los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia.
7. Los resultados representativos:
Este procedimiento de cultivo tritón ires que las células se ha utilizado para estudiar el potencial de regeneración de la parte dorsal y ventral de las células IPE. Por otra parte, también es posible estudiar los genes específicos que contribuyen a la regeneración del mecanismo de la lente en el ojo de tritón. Cuando las células han sido cultivadas durante dos semanas (Figura 1) pueden ser transfectadas por los genes para examinar su función en la regeneración de la lente. De particular interés son los genes que pueden inducir el iris ventral. Dado que el ventral las células del iris no puede transdiferenciarse a la lente (Figura 2) la función de inducción de un gen candidato puede ser estudiado. En el pasado, con esta técnica se ha demostrado que, cuando seis-3 se expresó sobre la presencia de la inducción de la lente ácido retinoico se observó desde el ventral iris 6. En la figura 3 se puede observar que el ventral agregado iris dio lugar a una lente completamente desarrollado y diferenciado (cabeza de flecha), no diferente de la lente de host de la dorsal del iris (flecha).
Figura 1. a) dorsal iris células epiteliales pigmentadas cultivados in vitro durante un periodo de 2 semanas. b) ventral iris células epiteliales pigmentadas cultivados in vitro durante un periodo de 2 semanas. Tenga en cuenta que persiste la pigmentación de esta etapa en las células del iris dorsal y ventral.
Figura 2. La regeneración de la capacidad de los cultivos de células de IPE. a) la inducción de la lente de agregados celulares dorsal IPE (cabeza de flecha). Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha), di: dorsal iris, vi: ventral iris, le: epitelio del cristalino, Si: las fibras del cristalino. b) La ausencia de inducción de la lente de agregados de células IPE ventral (flecha). Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha).
Figura 3. La inducción de la lente de agregado ventral transfectadas con seis-3 y se trata con ácido retinoico. Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha). Lente de la inducción de agregado ventral (flecha).
Discussion
Este protocolo se ha establecido un sistema in vitro para estudiar los mecanismos de regeneración en la lente de tritones. Dado que los agregados (ya sea dorsal o ventral siguen fielmente a sus comportamiento in vivo durante la regeneración de esta técnica puede aliviar el enorme esfuerzo necesario para la transgénesis en tritones y puede ser usado para ganancia de función, así como la pérdida de 7,8,9 experimentos de la función. También , los agregados o el iris en su conjunto se puede tratar fácilmente con factores de crecimiento y examinar sus efectos como se describe en este protocolo. Por ejemplo, el papel de la vía BMP ha sido estudiado con esta técnica 6.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH Ey10540 a PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
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