Summary
Un procedimiento eficaz para evaluar la propensión de oligomerización dominios transmembrana de un solo paso (TTM) se describe. Proteínas quiméricas que consiste en la DTM fundido a toxR se expresan en una cepa de E. coli reportero. TMD inducida por oligomerización causas dimerización de toxR, activación de la transcripción y la producción de la proteína reportera,-galactosidasa.
Abstract
El punto de vista simplista de los dominios transmembrana de la proteína como un mero anclas en bicapas de fosfolípidos desde hace mucho tiempo que ya fueron desbancados. En muchos casos, que atraviesa la membrana las proteínas han desarrollado mecanismos muy sofisticados de acción. 3.1 Una forma en que las proteínas de membrana son capaces de modular sus estructuras y funciones es por contacto directo y específico de las hélices hidrofóbicas, formando oligómeros estructura transmembrana. 4,5 Mucho recientes el trabajo se ha centrado en la distribución de los aminoácidos preferentemente en el medio ambiente de la membrana en comparación con una solución acuosa y las fuerzas intermoleculares diferentes que la asociación de proteínas en coche. 6,7 Sin embargo, los estudios de reconocimiento molecular en el dominio transmembrana de las proteínas aún por detrás de los de soluble en agua las regiones. El principal obstáculo sigue siendo: a pesar de la especificidad y afinidad notable que oligomerización transmembrana puede lograr, 8 medición directa de su asociación es un reto. Las metodologías tradicionales aplicadas al estudio de la función integral de proteína de la membrana puede ser obstaculizada por la insolubilidad inherente de las secuencias en estudio. Puntos de vista biofísico adquiridos al estudiar péptidos sintéticos que representan los dominios transmembrana puede proporcionar una visión estructural de utilidad. Sin embargo, la importancia biológica de las micelas de detergente o de los sistemas de liposomas utilizados en estos estudios para imitar las membranas celulares con frecuencia se cuestiona, no adoptar una estructura de péptidos nativos-como en estas condiciones y que su comportamiento funcional, reflejen verdaderamente el modo de acción dentro de una membrana nativa ? Con el fin de estudiar las interacciones de las secuencias transmembrana en bicapas de fosfolípidos naturales, el laboratorio Langosch desarrollado ensayos toxR transcripcional reportero. 9 El dominio transmembrana de interés se expresa como una proteína quimérica con la proteína de unión a maltosa para la ubicación de la periplasma y toxR que presente un informe del nivel de oligomerización (Figura 1).
En la última década, varios otros grupos (por ejemplo, Engelman, DeGrado, Shai) optimizado y aplicado este reportero de ensayo toxR. 10-13 Los ensayos toxR varios se han convertido en un estándar de oro para probar interacciones proteína-proteína en las membranas celulares. Nosotros en este documento demuestran una operación típica experimental llevado a cabo en nuestro laboratorio que todo sigue los protocolos desarrollados por Langosch. Este método de aplicación general es útil para el análisis de dominio de transmembrana la libre asociación de E. coli, donde se utiliza β-galactosidasa de producción para evaluar la propensión oligomerización TMD. Al TMD inducida por dimerización, toxR se une al promotor ctx causando la regulación del gen lacZ de β-galactosidasa. Una lectura colorimétrica se obtiene mediante la adición de ONPG a las células lisadas. Escisión hidrolítica de ONPG por los resultados de β-galactosidasa en la producción de la especie que absorbe la luz o-nitrofenolato (ONP) (Figura 2).
Protocol
1. Consideraciones sobre la clonación
- Oligonucleótidos preparados comercialmente, en representación de la TMD de interés flanqueado por NheI y sitios de restricción BamHI y 5 'fosforilados se pueden ligar en pTox7 (modificado en nuestro laboratorio mediante la inserción de un par de bases directamente después de que el sitio de restricción BamHI 14) (Figura 3) digerido secuencialmente con BamHI y NheI. Un oligonucleótido ejemplo se muestra a continuación:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
La secuencia de TMD debe ser 12-24 residuos (las secuencias más cortas, presumiblemente, se prolongarán por residuos hidrofóbicos vector codificado). Con el fin de investigar la interfaz, cuatro variantes del diseño TMD se debe crear en inserciones secuenciales de residuos y residuos concomitante resultado deleciones en la rotación de la relativa a la TMD toxR 15,16. Por último, la concentración de arabinosa se debe variar entre 0,001 y 0,01% (w / v) para identificar la concentración máxima en que las diferencias en las señales de galactosidasa β-entre las diferentes secuencias de TMD se observan, pruebas de diferentes niveles de expresión, se recomienda identificar las condiciones bajo las cuales las afinidades se pueden distinguir mejor. Además de arabinosa y antibióticos, 0,4 mM IPTG se puede utilizar para resaltar las diferencias de afinidades entre TTM diferentes. La medición toxR debe realizar por lo menos en cuatro ejemplares. Todo el procedimiento se debe repetir por lo menos tres veces con diferentes transformaciones plásmido.
2. El crecimiento de los cultivos bacterianos
- Suavemente deshielo FHK12 células competentes (200 l) en el hielo y la transferencia en un tubo de cultivo de 15 ml. Añadir ADN plásmido (200 ng) e incubar las células en hielo durante 30 min.
- Choque térmico de las células mediante la incubación durante 90 s en 42 ° C, seguido de incubación en hielo durante 2 min.
- Añadir SOC medios de comunicación (800 l) y se incuban las muestras a 37 ° C con agitación (300 rpm) durante una h.
- Inocular 5 ml de LB medios con cloranfenicol (30 mg / ml) y arabinosa (0,0025% w / v) con 50 l de la mezcla de transformación en tubos de 15 ml de cultivo por triplicado. Incubar las muestras a 37 ° C con agitación (300 rpm) durante 20 h. (También 5 l de la cultura se puede utilizar para inocular 100 l de medio en una placa de 96 pocillos. Este método es útil cuando se trata de un gran número de muestras, a pesar de los errores será ligeramente superior. Con el fin de evitar la evaporación, lo que llevaría de error, llenar los pozos ultraperiféricas con los medios de comunicación, pero no las utilizan para las muestras. Por último, haga doble envoltura de la articulación entre la tapa y la placa con parafilm).
3. Medición de la actividad β-galactosidasa
- Precaliente la placa-lector a 28 ° C.
- Transferir el Z-buffer en un depósito con una gran punta de la pipeta, asegurándose de que sólo ocupan la parte superior (acuosa) de la capa. Transferencia de 100 l de Z-buffer/chloroform recién preparada a los pocillos de una placa de 96 pocillos. La transferencia de 5 l de cada cultura en los pocillos de la placa en cuatro ejemplares. Omitir la cultura de los cuatro pozos que servirá como blanco.
- Mida el diámetro exterior 595 de la placa para determinar la densidad celular.
- Añadir 50 l de Z-buffer/SDS a todos los pocillos de la placa. Agitar la placa en la placa-lector durante 10 minutos para Lyze las células. Asegúrese de que las suspensiones celulares son claras después de la lisis y repita el paso agitando si es necesario. Lisis incompleta sugiere la Z-buffer/chloroform no estaba recién preparado.
- Añadir 50 l recién preparada Z-buffer/ONPG a todos los pozos y devolver el plato para el lector de placas y medir OD 405 cada 30 s durante 20 min.
- Calcular β-galactosidasa actividad mediante la siguiente ecuación (recordando que restar el espacio en blanco). La relación de OD 405 / min, deberá calcularse utilizando todos los puntos de datos en el OD 405 entre 0.0 y 1.0 usando un modelo de ajuste lineal.
Unidades Miller difieren a veces cuando se graba en diferentes días. Por lo tanto, una construcción de referencia como GpA se debe medir en cada prueba. Sus valores pueden ser utilizados para la normalización de los valores toxR.
4. Control de la expresión de proteínas
- Realizar Western Blot para comprobar incluso la expresión de proteínas entre los constructos. Combine 50 l de las culturas por triplicado y se centrifuga (2000 rpm, 4 min) en una microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender el pellet residual en 2 x tampón de carga de la muestra.
- 7,5 l de carga en un gel estándar de 8% y llevar a cabo la electroforesis a 125 V durante 1 hora 5 min. Después de la transferencia, se incuba con anticuerpos anti-MBP HRP-anticuerpo conjugado y visualizar, la proteína quimérica se observa en aproximadamente 70 kDa con algunos productos de degradación a veces visto alrededor de 48 kDa. MBP endógena también se observa a 45 kDa (ver Figura 5).
5. De control para la inserción de la membrana adecuada
Una línea de células deficientes en la proteína de unión a maltosa se utiliza para evaluar la inserción adecuada de la membrana de la construcción de TMD quimérico. Cuando se cultiva en medio mínimo con maltosa como única fuente de carbono, sólo las células que expresan una membrana integral producto de expresión de proteínas de unión a maltosa correctamente ubicado al periplasma son capaces de crecer.
- Transformar las células PD28 (como se describe para FHK12 células) e inocular 2 ml de medio LB. Crecer las células a 37 ° C con agitación (300 rpm) durante la noche.
- Precipitar las células por centrifugación a 3500 rpm, 10 min, 4 ° C y se lavan mediante resuspensión en PBS (2 ml) por pipeteo suave con una buena propina o agitación suave. Que sedimenten las células (como antes), lavar con PBS por segunda vez, pellets y, finalmente, volver a suspender en PBS (1 ml).
- Utilice 25 l de células resuspendidas para inocular 5 ml de medio mínimo por triplicado y se incuba a 37 ° C con agitación (300 rpm). Tomar lecturas de OD 595 entre 15-25 h, aproximadamente cada 2 horas por la transferencia de 200 l de cada muestra en una placa de 96 pozos y la lectura utilizando la placa-lector.
6. Los resultados representativos:
Un ejemplo de la utilización del ensayo de reportero toxR transcripción para analizar la propensión de oligomerización dominios transmembrana en la muestra en la Figura 4. Anteriormente hemos investigado la oligomerización de los dominios transmembrana de la multispanning membrana de proteínas de membrana integral latente proteína-1 (LMP-1) por varias técnicas, incluyendo toxR 14 dominio transmembrana cinco (TM5) se demostró que presentan una fuerte tendencia a oligomerize.; Esto se demuestra por las altas unidades Miller, comparable a la del control positivo, el PAM, una secuencia bien establecida dimerizing. Una mutación deletérea en TM5, D150A, reduce la capacidad de la secuencia de oligomerize. LMP-1 TM1 no significativamente oligomerize y presenta una señal de la Unidad de Miller muy baja, justo por encima de la señal en blanco, no transformadas FHK12 células.
Dibujos Figura 1. Representa el reportero de ensayo toxR. Dominio transmembrana (TMD), impulsados resultados oligomerización en la dimerización de toxR y la activación de la transcripción de lacZ. El producto del gen de LacZ, β-galactosidasa se puede cuantificar como una medida de la propensión de un TMD de oligomerize.
Figura 2. La escisión hidrolítica de ONPG por los resultados de β-galactosidasa en la producción de la especie que absorbe la luz o-nitrofenolato (ONP).
Figura 3. Mapa del plásmido de pToxR7.
Figura 4. Representante ensayo toxR reportero transcripcional analizar la propensión de oligomerización de la proteína latente de membrana-1 dominios transmembrana. Dominio transmembrana 5 (TM5) oligomeriza fuertemente, mientras que un dominio transmembrana (TM1) exhibe sólo una interacción débil. D150A mutación en TM5 reduce de forma significativa su capacidad para oligomerize. GpA se incluye como una secuencia de control positivo para la dimerización fuerte. Blanco representa sin transformar FHK12 células.
Figura 5. Western blot para la expresión de la proteína.
Figura 6. PD28 ensayo de complementación para el control de la inserción correcta de la membrana del periplasma. Control negativo representa una construcción deficiente en proteínas de unión a maltosa.
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Discussion
El ensayo toxR reportero de la transcripción es una forma fácil para identificar las secuencias transmembrana con el potencial de oligomerize. Dado que las interacciones se producen dentro de la membrana interna bacteriana, este ensayo se eludan las cuestiones relacionadas con la validez de los sistemas que estudian en la membrana mimética-ambientes. Teniendo en cuenta que la clonación de TTM múltiples en un solo plásmido fácilmente se puede hacer en paralelo y el ensayo completo se puede realizar en formato de 96 pocillos de placas, este ensayo puede ser utilizado para el análisis de alto rendimiento de un gran número de secuencias de proteínas. 17 Una vez que un interacción ha sido detectado, los residuos funcionales clave puede ser interrogado por el análisis mutacional, lo que permite el mapeo de las características estructurales necesarios. En muchos casos, el análisis de cristalografía de proteínas transmembrana es problemático, lo que requiere instrumentos alternativos tales como el ensayo toxR para establecer las bases moleculares de la función.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a los Institutos Nacionales de Salud (1R21CA138373 y Stand Up to Cancer (SU2C) para apoyos financieros de este trabajo. HY está agradecido por el premio Elion 2009 de la Asociación Americana de Investigación del Cáncer, el Premio Académico Kimmel de la Fundación Sidney Kimmel para Investigación sobre el Cáncer (SKF-08-101), y el Premio Nacional de Ciencias Facultad de Carrera Temprana Fundación (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
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