Summary
Ett effektivt förfarande för att bedöma oligomerisering benägenhet enpassage transmembrana domäner (TMDS) beskrivs. Chimär proteiner bestående av TMD smält till ToxR uttrycks i en E. coli-reporter stam. TMD-inducerad oligomerisering orsaker dimerization av ToxR, aktivering av transkription och produktion av reportern protein-galaktosidas.
Abstract
Den onyanserade bild av domäner protein transmembrana endast som ankare i fosfolipid bilayers sedan länge motbevisat. I många fall membran-spänner proteiner har utvecklats mycket sofistikerade verkningsmekanismer. 1-3 Ett sätt på vilket membranproteiner kan modulera deras strukturer och funktioner är av direkta och specifika kontakt hydrofoba helixar, som utgör strukturerade transmembranösa oligomerer. 4,5 Mycket senare Arbetet har fokuserat på distribution av aminosyror företrädesvis finns i membranet miljö jämfört med vattenlösning och de olika krafter intermolekylära som driver protein föreningen. 6,7 dock studier av molekylär igenkänning vid transmembrana domän proteiner fortfarande släpar efter de vattenlösliga regioner. Ett stort hinder kvarstår: Trots den märkliga specificitet och affinitet som transmembrane oligomerisering kan uppnå, är 8 direkt mätning av deras förening utmanande. Traditionella metoder tillämpas för att studera integrerade membranprotein funktion kan hämmas av den inneboende olöslighet av de sekvenser som granskas. Biofysiska insikter från att studera syntetiska peptider som representerar transmembrana domäner kan ge värdefull strukturell insikt. Men den biologiska relevansen av rengöringsmedel micellär eller liposomer som används i dessa studier för att efterlikna cellmembran ofta ifrågasatts, gör peptider anta en infödd-liknande struktur under dessa förhållanden och inte deras funktionella beteendet verkligen återspeglar verkningsmekanismen inom en infödd membran ? För att studera interaktioner mellan transmembrana sekvenser i naturliga fosfolipid bilayers utvecklade Langosch labbet ToxR transkriptionell reporter analyser. 9 det transmembrana domän av intresse uttrycks som en chimär protein med maltos bindande protein för plats till periplasm och ToxR att lämna en rapport av nivån på oligomerisering (Figur 1).
Under det senaste decenniet har flera andra grupper (t.ex. Engelman, DeGrado, Shai) optimeras ytterligare och tillämpat denna analys ToxR reporter. 10-13 De olika ToxR-analyser har blivit en guldmyntfot att testa protein-protein interaktioner i cellmembranen. Vi visar här ett typiskt experimentell verksamhet bedrivs i vårt laboratorium som i första hand följer protokoll som utvecklats av Langosch. Denna allmängiltig metod är användbar för analys av transmembrana domän själv-förening i E. coli, där β-galaktosidas produktionen används för att bedöma TMD oligomerisering benägenhet. Vid TMD-inducerad dimerization, binder ToxR till ctx promotor orsakar uppreglering av LacZ genen för β-galaktosidas. En kolorimetrisk avläsning erhålls genom tillsats av ONPG till lyzed celler. Hydrolytisk klyvning av ONPG av β-galaktosidas resultat i produktionen av ljusabsorberande arter o-nitrophenolate (ONP) (Figur 2).
Protocol
1. Kloning Överväganden
- Kommersiellt beredd oligonukleotider som representerar TMD intresse flankerad av NheI och BamHI platser restriktioner och 5'-fosforyleras kan knyts ihop till pTox7 (modifierad i vårt laboratorium genom införande av ett baspar direkt efter BamHI begränsningen plats 14) (Figur 3) smält sekventiellt med BamHI och NheI. Ett exempel oligonukleotid visas nedan:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 "gTMDSEQUENCEcctag5"
Den TMD sekvensen bör 12-24 rester (kortare sekvenser kommer förmodligen att långsträckt med vektorns kodade hydrofob rester). För att undersöka gränssnittet bör fyra varianter av TMD konstruktionen skapas där sekventiell rester infogningar och samtidig strykningar rester resulterar i rotation av TMD förhållande till ToxR. Slutligen 15,16 bör arabinos koncentrationen varierade mellan 0,001 och 0,01% (w / v) att fastställa den koncentration där maximal skillnader i β-galaktosidas signaler mellan olika TMD sekvenser iakttas, testa olika uttryck nivåer rekommenderas att identifiera vilka villkor olika tillhörighet kan skiljas bäst. Förutom arabinos och antibiotika, kan 0,4 mM IPTG användas för att förbättra skillnader i släktskap mellan olika TMDS. Den ToxR mätning bör utföras åtminstone i fyra exemplar. Hela proceduren bör upprepas minst tre gånger med olika plasmid transformationer.
2. Tillväxt av bakteriekulturer
- Försiktigt tina FHK12 behöriga celler (200 l) på is och överför till en 15 ml kultur rör. Lägg plasmid-DNA (200 ng) och inkubera cellerna på is i 30 min.
- Heat-shock celler genom inkubation under 90 s vid 42 ° C, följt av inkubering på is i 2 min.
- Lägg till SOC media (800 l) och inkubera proverna vid 37 ° C med skakningar (300 rpm) i en h.
- Inokulera 5 medier ml LB med kloramfenikol (30 mikrogram / ml) och arabinos (0,0025% w / v) med 50 l av omvandlingen blandningen i 15 tuber ml kultur i tre exemplar. Inkubera prov vid 37 ° C med skakningar (300 rpm) i 20 h. (Alternativt 5 ìl av kultur kan användas för att ympa 100 l av mediet i ett 96-brunnar. Denna metod är användbar när man hanterar ett stort antal prover, men felen kommer att bli något högre. För att undvika avdunstning, som skulle leda för fel, fylla de yttersta brunnarna med media, men inte använder dem för prover. Slutligen, dubbel-wrap skarven mellan locket och plåten med parafilm).
3. Mätning av β-galaktosidas aktivitet
- Värm plattan-läsaren till 28 ° C.
- Överför Z-bufferten i en reservoar med en stor pipettspets och se till att bara ta upp den övre (vattenlösning) skikt. Överför 100 ìl av nylagade Z-buffer/chloroform till brunnarna på en 96-brunnar. Överföring 5 ìl av varje kultur i brunnar i plattan i fyra exemplar. Utelämna kulturen från fyra brunnar som ska fungera som tomt.
- Mät OD 595 av plattan för att bestämma celltätheten.
- Tillsätt 50 ìl Z-buffer/SDS till alla brunnar i plattan. Skaka plattan i plåt-läsare i 10 min till Lyze cellerna. Se till att cellsuspensioner är klart efter lysering och upprepa skaka steg om det behövs. Ofullständig lys föreslår Z-buffer/chloroform inte var nygjord.
- Tillsätt 50 l nylagade Z-buffer/ONPG till alla brunnar och återgå plattan i plattläsaren och mäta OD 405 var 30 s för 20 min.
- Beräkna β-galaktosidas aktivitet med hjälp av följande ekvation (kom ihåg att subtrahera det tomma). Förhållandet mellan OD 405 / min bör beräknas med hjälp av alla datapunkter i OD 405 intervallet 0,0 till 1,0 med hjälp av en linjär modell passform.
Miller enheter skiljer sig åt ibland när inspelade på olika dagar. Därför bör en hänvisning konstruktion som GPA mätas i varje test. Dess värden kan användas för normalisering av ToxR värden.
4. Kontroll för Protein Expression
- Utför Western blotting för att verifiera ens proteinuttryck mellan konstruktioner. Kombinera 50 ìl av tre exemplar kulturer och centrifugera (2000 rpm, 4 min) i mikrocentrifug. Avlägsna supernatanten genom att pipettera och återsuspendera resterande pelleten i 2 x prov buffert.
- Belastning 7,5 l på en vanlig 8% gel och utföra electrophoreses vid 125 V under 1 timme 5 min. Efter överföring, inkuberas med anti-MBP HRP-konjugerade antikroppen och visualisera, den chimära protein har observerats vid ungefär 70 kDa med några nedbrytningsprodukter ibland ses runt 48 kDa. Endogena MBP är också observeras vid 45 kDa (se Figur 5).
5. Kontroll för korrekt Membrane Inläggning
En cellinje bristfällig i maltos bindande protein används för att bedöma korrekt membran införandet av den chimära TMD konstruera. När odlas på minimal media med maltos som enda kolkälla, bara celler som uttrycker ett membran-integrerad uttryck produkt med maltos bindande protein korrekt placerad till periplasm kan växa.
- Transform PD28 celler (som beskrivs för FHK12 celler) och inokulera 2 ml LB medium. Odla cellerna vid 37 ° C med skakningar (300 rpm) över natten.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 3500 rpm, 10 min, 4 ° C och tvätta av resuspension i PBS (2 ml) genom att försiktigt pipettera med en stor spets eller mild vortexa. Pellet cellerna (som ovan), tvätta med PBS för andra gången, pellets och slutligen resuspendera i PBS (1 ml).
- Använd 25 l återsuspenderad celler för att inokulera 5 ml minimal medier i tre exemplar och inkubera vid 37 ° C med skakningar (300 rpm). Ta OD 595 avläsningar mellan 15-25 h, ungefär var 2 timmar genom att överföra 200 l av varje prov i en 96-brunnars platta och läsa med hjälp av plattan-läsare.
6. Representativa resultat:
Ett exempel på användningen av ToxR transkriptionell reportern analys för att analysera oligomerisering benägenhet transmembrana domäner i Figur 4. Tidigare har vi undersökt oligomerisering av transmembrana domäner från multispanning membran-integrerad protein latent membranprotein-1 (LMP-1) genom olika tekniker, bland annat ToxR 14 transmembran domän fem (TM5) visades att uppvisa en stark benägenhet att oligomerize. Detta visas av hög Miller enheter, jämförbar med den positiva kontrollen, GPA, en väl etablerad dimerizing sekvens. En skadlig mutation i TM5, D150A minskar möjligheten för sekvensen för att oligomerize. LMP-1 TM1 inte signifikant oligomerize och uppvisar en mycket låg Miller Unit signal, precis ovanför signalen för tomma, icke-omvandlad FHK12 celler.
Figur 1. Cartoon visar analysen ToxR reporter. Transmembrana domän (TMD) drivs oligomerisering resulterar i dimerization av ToxR och aktivering av LacZ transkription. Genen produkt av LacZ kan β-galaktosidas kvantifieras som ett mått på benägenhet en TMD till oligomerize.
Figur 2. Hydrolytiska klyvning av ONPG av β-galaktosidas resultat i produktionen av ljusabsorberande arter o-nitrophenolate (ONP).
Figur 3. Plasmid karta över pToxR7.
Figur 4. Representant ToxR transkriptionell reporter analys analysera oligomerisering benägenhet latent membranprotein-1 transmembrane domäner. Transmembrana domän 5 (TM5) oligomerizes starkt, medan transmembrana domän 1 (TM1) uppvisar endast en svag växelverkan. Mutation D150A i TM5 reducerar sin förmåga att oligomerize. GPA ingår som en positiv kontroll sekvens för starka dimerization. Tom representerar oomvandlad FHK12 celler.
Figur 5. Western blot för protein uttryck.
Figur 6. PD28 komplettering analys för att kontrollera för korrekt membran isättning till periplasm. Negativ kontroll representerar en konstruktion med brist på maltos bindande protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ToxR transkriptionell reporter-analysen är ett lättvindigt sätt att identifiera transmembrana sekvenser med potential att oligomerize. Eftersom interaktioner sker inom den bakteriella inre membranet, kringgår denna analys av frågor i samband med giltigheten av att studera system i membran-mimetiska miljöer. Med tanke på att kloning av flera TMDS i en enda plasmid lätt kan ske parallellt och hela analysen kan utföras i 96-brunnar format, kan detta test användas för hög genomströmning analys av stora mängder av protein-sekvenser. 17 När ett interaktion har upptäcks kan nyckeln funktionella rester förhördes av mutationsstatus analys, vilket gör att kartläggningen av de inblandade strukturella egenskaper. I många fall är kristallografiska analys av transmembrana proteiner problem, som kräver alternativa verktyg som ToxR analys för att fastställa den molekylära grunden för funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar National Institutes of Health (1R21CA138373 och Stand Up till Cancer (SU2C) för finansiellt stöd i detta arbete. HY är tacksam för 2009 Elion Award från American Association of Cancer Research, en Kimmel Scholar Award från Sidney Kimmel Stiftelsen för Cancer Research (SKF-08-101) och National Science Foundation fakulteten tidiga karriär Award (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G.
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K.
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
