Summary
एकल पास transmembrane डोमेन की oligomerization प्रवृत्ति (TMDs) का आकलन करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया में वर्णित है. Chimeric ToxR के लिए इनकार TMD से मिलकर प्रोटीन ई. कोलाई संवाददाता तनाव में व्यक्त कर रहे हैं. TMD प्रेरित oligomerization ToxR, प्रतिलेखन और रिपोर्टर प्रोटीन के उत्पादन, galactosidase के सक्रियण के dimerization का कारण बनता है.
Protocol
1. क्लोनिंग संबंधी बातें
- व्यावसायिक तौर पर तैयार NheI और BamHI प्रतिबंध साइटों और 5'-phosphorylated द्वारा flanked ब्याज की TMD प्रतिनिधित्व oligonucleotides pTox7 (एक आधार जोड़ी के सम्मिलन से हमारी प्रयोगशाला में BamHI प्रतिबंध 14 साइट के बाद सीधे संशोधित) (चित्रा 3) क्रमिक रूप से पच में ligated किया जा सकता है है BamHI और NheI साथ. एक उदाहरण oligonucleotide नीचे दिखाया गया है:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
TMD अनुक्रम 12-24 अवशेष (छोटे दृश्यों संभाव्यतः वेक्टर इनकोडिंग हाइड्रोफोबिक अवशेषों के द्वारा लम्बी जाएगा) होना चाहिए. आदेश में इंटरफेस की जांच करने के लिए, TMD डिजाइन के चार वेरिएंट जहां अनुक्रमिक अवशेषों सम्मिलन और ToxR के लिए TMD रिश्तेदार के रोटेशन में सहवर्ती अवशेषों विलोपन परिणाम 15,16 अंत में, arabinose एकाग्रता 0.001 और 0.01% के बीच विविध किया जाना चाहिए बनाया जाना चाहिए (w / v) एकाग्रता जहां अलग TMD दृश्यों के बीच β galactosidase संकेतों में अधिकतम अंतर मनाया जाता है की पहचान करने के लिए, अलग अभिव्यक्ति के स्तर का परीक्षण करने के लिए शर्तों जिसके तहत विभिन्न समानताएं सबसे अच्छा प्रतिष्ठित किया जा सकता है की पहचान की सिफारिश की है. Arabinose और एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा, 0.4 मिमी IPTG समानताएं के विभिन्न TMDs के बीच मतभेद को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ToxR माप चार प्रतियों में कम से कम किया जाना चाहिए. पूरी प्रक्रिया अलग प्लाज्मिड परिवर्तनों के साथ कम से कम तीन बार दोहराया जाना चाहिए.
2. बैक्टीरियल संस्कृतियों की ग्रोथ
- एक 15 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में बर्फ और हस्तांतरण पर धीरे FHK12 सक्षम कोशिकाओं (200 μl) पिघलना. प्लास्मिड डीएनए (200 एनजी) जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर कक्षों को सेते हैं.
- 42 पर 90 एस के लिए हीट झटका ऊष्मायन द्वारा कोशिकाओं ° सी, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन द्वारा बाद.
- समाज मीडिया जोड़ें (800 μl) और 37 पर नमूने सेते ° सी एक एच. के लिए मिलाते (300 आरपीएम) के साथ
- (30 μg / मिलीलीटर) chloramphenicol और arabinose (.0025% w / v) के साथ तीन प्रतियों में 15 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूबों में परिवर्तन के मिश्रण के 50 μl के साथ 5 मिलीलीटर लेग मीडिया का टीका लगाना. 37 नमूनों में सेते ° C 20 एच. के लिए मिलाते (300 आरपीएम) के साथ (वैकल्पिक रूप से संस्कृति के 5 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में माध्यम की 100 μl टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस विधि उपयोगी है जब नमूनों की बड़ी संख्या के साथ निपटने, हालांकि त्रुटियों थोड़ा अधिक हो जाएगा. आदेश में वाष्पीकरण, जो नेतृत्व करेंगे से बचने के लिए त्रुटि, मीडिया के साथ भरने के बाह्यतम कुओं, लेकिन नमूनों के लिए उन्हें का उपयोग नहीं अंत में, ढक्कन और parafilm के साथ प्लेट के बीच संयुक्त डबल लपेटो)..
3. Β-galactosidase गतिविधि के मापन
- थाली पाठक 28 डिग्री सेल्सियस पहले से गरम करना
- एक जलाशय में z-बफर, एक बड़े विंदुक टिप के साथ स्थानांतरण करने के लिए केवल ऊपरी परत (जलीय) ले सुनिश्चित करने. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं को हौसले से तैयार Z-buffer/chloroform के 100 μl स्थानांतरण. प्रत्येक संस्कृति के चार प्रतियों में थाली के कुओं में 5 μl स्थानांतरण. चार कुओं जो खाली के रूप में काम करेगा से संस्कृति छोड़ें.
- आयुध डिपो 595 की थाली सेल घनत्व निर्धारण करने के लिए उपाय.
- प्लेट के सभी कुओं को Z-buffer/SDS के 50 μl जोड़ें. 10 से कोशिकाओं lyze मिनट के लिए थाली थाली रीडर में हिलाएँ. सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन lysis के बाद स्पष्ट कर रहे हैं और यदि आवश्यक मिलाते हुए कदम दोहराने. अधूरा lysis पता चलता है Z-buffer/chloroform हौसले से तैयार नहीं था.
- 50 हौसले सभी कुओं को Z-buffer/ONPG तैयार μl जोड़ें और थाली प्लेट रीडर और उपाय 405 आयुध डिपो के लिए 20 मिनट के लिए हर 30 एस वापस.
- Β-galactosidase गतिविधि की गणना निम्नलिखित समीकरण (रिक्त घटाना याद) का उपयोग. 405 आयुध डिपो / मिनट के अनुपात आयुध डिपो 405 0.0 रेंज में सभी डेटा बिंदुओं का उपयोग कर 1.0 के लिए एक रेखीय मॉडल फिट का उपयोग कर की गणना की जानी चाहिए.
मिलर इकाइयों कभी कभी अलग है जब अलग अलग दिनों पर दर्ज है. इसलिए, GPA की तरह एक संदर्भ का निर्माण प्रत्येक परीक्षा में मापा जाना चाहिए. अपने मूल्यों ToxR मूल्यों की सामान्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
4. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण
- पश्चिमी constructs के बीच भी प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि प्रदर्शन सोख्ता. Microcentrifuge में तीन प्रतियों संस्कृतियों और अपकेंद्रित्र के 50 μl (2000 rpm, 4 मिनट) का मिश्रण. Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें और 2 एक्स नमूना लोड हो रहा है बफर में अवशिष्ट गोली resuspend.
- एक मानक 8% जेल पर 7.5 μl लोड और 1 घंटे 5 मिनट के लिए 125 वी पर electrophoreses ले. हस्तांतरण के बाद, विरोधी MBP एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सेते और कल्पना, chimeric प्रोटीन कुछ गिरावट कभी कभी 48 केडीए के आसपास देखा उत्पादों के साथ लगभग 70 केडीए पर मनाया जाता है. अंतर्जात MBP 45 केडीए में भी मनाया जाता है (देखें चित्र 5).
5. उचित झिल्ली निवेशन के लिए नियंत्रण
एक सेल maltose बंधनकारी प्रोटीन में कमी लाइन chimeric TMD का निर्माण का उचित झिल्ली सम्मिलन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जब maltose के साथ कम से कम मीडिया पर एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में हो, केवल कोशिकाओं maltose बाध्यकारी प्रोटीन periplasm करने के लिए सही ढंग से स्थित के साथ एक झिल्ली अभिन्न अभिव्यक्ति उत्पाद व्यक्त विकसित करने में सक्षम हैं.
- रूपांतरण PD28 कोशिकाओं (के रूप में FHK12 कोशिकाओं के लिए वर्णित) और लेग माध्यम से 2 मिलीलीटर टीका लगाना. 37 पर कोशिकाओं के विकास ° C (300 आरपीएम) मिलाते रातोंरात के साथ.
- गोली centrifugation द्वारा rpm 3500 में कोशिकाओं, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस और पीबीएस (2 एमएल) में resuspension द्वारा एक बड़ी टिप या कोमल vortexing के साथ कोमल pipetting द्वारा धो लो. कोशिकाओं (ऊपर के रूप में) गोली, पीबीएस के साथ एक दूसरी बार के लिए धोने, गोली और अंत में पीबीएस (1 एमएल) में resuspend.
- Resuspended कोशिकाओं के 25 μl का उपयोग करने के लिए 37 पर तीन प्रतियों और सेते में 5 मिलीलीटर कम से कम मीडिया का टीका लगाना ° मिलाते हुए (300 rpm) के साथ सी. आयुध डिपो 15-25 घंटे, एक 96 अच्छी तरह से थाली और पढ़ने प्लेट रीडर का उपयोग में प्रत्येक नमूना के 200 μl स्थानांतरित द्वारा लगभग हर 2 घंटे के बीच 595 रीडिंग ले लो.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
ToxR transcriptional रिपोर्टर में transmembrane डोमेन 4 चित्र में दिखाया के oligomerization प्रवृत्ति विश्लेषण परख के उपयोग का एक उदाहरण है. हम पहले से transmembrane डोमेन के oligomerization की जांच की है multispanning झिल्ली अभिन्न प्रोटीन अव्यक्त झिल्ली प्रोटीन 1 ToxR सहित विभिन्न तकनीकों, के द्वारा (LMP-1) 14 transmembrane पाँच डोमेन (TM5) के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति oligomerize प्रदर्शन दिखाया गया था. इस उच्च मिलर इकाइयों, सकारात्मक नियंत्रण करने के लिए तुलनीय, GPA, एक अच्छी तरह से स्थापित dimerizing अनुक्रम द्वारा प्रदर्शन किया है. TM5, D150A, में एक हानिकारक उत्परिवर्तन के अनुक्रम की क्षमता के लिए oligomerize कम कर देता है. LMP-TM1 एक काफी oligomerize और नहीं करता है रिक्त, गैर तब्दील FHK12 कोशिकाओं के लिए संकेत बस के ऊपर एक बहुत ही कम मिलर यूनिट संकेत, दर्शाती है.
चित्रा 1 कार्टून ToxR संवाददाता परख चित्रण. Transmembrane डोमेन (TMD) ToxR और LacZ प्रतिलेखन के सक्रियण के dimerization में oligomerization परिणाम चालित. LacZ के जीन उत्पाद है, β-galactosidase TMD oligomerize की प्रवृत्ति के एक उपाय के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
चित्रा 2. ONPG के प्रकाश को अवशोषित O-nitrophenolate (ONP) प्रजातियों के उत्पादन में β galactosidase परिणामों से hydrolytic दरार.
चित्रा 3 pToxR7 के प्लाज्मिड नक्शा.
चित्रा 4 प्रतिनिधि ToxR transcriptional संवाददाता परख अव्यक्त झिल्ली प्रोटीन-1 transmembrane डोमेन के oligomerization प्रवृत्ति का विश्लेषण . Transmembrane 5 डोमेन (TM5) जोरदार oligomerizes transmembrane एक डोमेन (TM1) whilst केवल एक कमजोर बातचीत दर्शाती है. TM5 में उत्परिवर्तन D150A काफी इसकी oligomerize क्षमता कम कर देता है. GPA मजबूत dimerization के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम के रूप में शामिल है. खाली untransformed FHK12 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 5 प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पश्चिमी धब्बा .
चित्रा 6 PD28 complementation परख सही झिल्ली periplasm सम्मिलन के लिए नियंत्रण . नकारात्मक नियंत्रण का निर्माण maltose बाध्यकारी प्रोटीन में कमी का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
ToxR transcriptional संवाददाता परख सतही oligomerize क्षमता के साथ transmembrane दृश्यों की पहचान का तरीका है. चूंकि बातचीत बैक्टीरियल भीतरी झिल्ली के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं, इस परख झिल्ली अनुकरण करनेवाला वातावरण में अध्ययन प्रणाली की वैधता के साथ जुड़े मुद्दों circumvents. यह देखते हुए कि समानांतर में एकाधिक TMDs के एक एकल प्लाज्मिड में क्लोनिंग आसानी से किया जा सकता है और पूरे परख 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में किया जा सकता है, इस परख प्रोटीन दृश्यों की बड़ी संख्या के उच्च throughput विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 17 एक एक बार बातचीत का पता लगाया गया है, कुंजी कार्यात्मक अवशेषों mutational विश्लेषण से पूछताछ किया जा सकता है, संरचनात्मक सुविधाओं के शामिल मैपिंग की अनुमति. कई मामलों में, transmembrane प्रोटीन का crystallographic विश्लेषण समस्याग्रस्त है, ToxR परख के रूप में वैकल्पिक उपकरण की आवश्यकता समारोह के आणविक आधार की स्थापना.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1R21CA138373 धन्यवाद और इस काम के वित्तीय समर्थन के लिए कैंसर (SU2C) करने के लिए स्टैंड अप हरियाणा के लिए कैंसर, Sidney Kimmel फाउंडेशन से एक Kimmel विद्वान पुरस्कार अनुसंधान के अमेरिकन एसोसिएशन से 2009 Elion पुरस्कार के लिए आभारी है. कैंसर रिसर्च (SKF-08-101), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन संकाय जल्दी कैरियर पुरस्कार (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
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