Summary
Bevaras insulin signalvägar finns i bananfluga
Abstract
Bevaras näringsämnen avkänning mekanismer finns mellan däggdjur och fruktflugor där peptider som liknar däggdjur insulin och glukagon, respektive funktion att upprätthålla glukoshomeostas under utveckling larvstadier 1,2. Studier på i stort sett efter mitotiska vuxna flugor har visat störning av glukos homeostas som resultat av genetiska ablation av insulin-like peptid (IUP) som producerar celler (IPC) 3. Således vuxna bananflugor är mycket lovande som ett lämpligt genetiska modellsystem för metabola sjukdomar inklusive diabetes typ II. För att ytterligare utveckla systemet bananfluga, måste jämföras fysiologiska test som används för att mäta glukostolerans och insulinkänslighet i däggdjur fastställas. För detta ändamål har vi nyligen beskrivit en ny procedur för att mäta muntliga svar glukostolerans i den vuxna flugan och påvisade betydelsen av vuxna IPC upprätthålla glukoshomeostas 4,5. Här har vi ändrat ett tidigare beskrivits förfarande för insulin injektion 6 och kombinerat det med en roman hemolymph extraktion metod för att mäta perifer insulinkänslighet i den vuxna flugan. Unikt, gör att våra protokoll direkta fysiologiska mätningar av den vuxna flugan förmåga att avyttra en perifer glukosbelastning vid injektionsstället, en metod som gör det möjligt att karakterisera insulin signalering mutanter och eventuella ingrepp som påverkar glukostolerans och insulinkänslighet i den vuxna flugan.
Protocol
1. Insulin beredning av lösningar
- Bered en färsk bovint insulin genom att lösa insulin i PBS för att uppnå en koncentration av 0,01 mg / ml. Både insulin / PBS och kontroll PBS lösningar måste förvaras på is under hela injektionen förfarandet. Dessa lösningar bör beredas med 0,5% (v / v) FD & C Blue No. 1 karamellfärg.
2. Nål beredning och injektion Set-up
- Förbered kapillär glas nålar med hjälp av en mikropipett puller.The följande avdragare inställningar ger nålar av tillräcklig kvalitet för injektion: Värme, 345, Pull, 210, Hastighet, 100, Tid, 200 (100 ms). Nyupptappat nålar måste vara trubbiga genom att trycka in spetsen genom en Kimwipe vävnad. Denna avtrubbning process tar bort den avlånga hög motståndskraft spets och ger en tjockare spets med en större pordiameter.
- Placera trubbiga nålar spetsen upp i en mikrocentrifugrör innehåller insulin / PBS lösning eller PBS ensam. Kapillärkraften resulterar i back-fyllning på varje nål. Observera nålspetsen under ett stereomikroskop att säkerställa att inget skräp eller luftbubblor visas i spetsen. Kassera nålar som inte fyller jämnt.
- Sätt fyllde nålar i den manuella microinjector nål och placera nålen hållaren med en mikromanipulator så att nålspetsen är synlig genom ett stereomikroskop. Applicera en positiv press på vätskan kolumn i nålen genom att vrida den manuella microinjector mikrometer ratten ansluten till kolven på microinjector sprutan.
- Kontrollera att tillräckligt tryck för kroppsvätskor har tillämpats genom att trycka en Kimwipe till nålspetsen och bekräfta vätskeflöde.
- När nålen har förberetts för injektionen, en kalibrering diagram fästa nålen axel med genomskinlig tejp, och föra nålspetsen i fokus genom ett stereomikroskop i 20X förstoring.
3. Fly Förberedelser
- Tio dagar gamla kvinnliga flugor används för injektion experiment. Samla flyger inom 24 h eclosion. Bedöva flyger med fuktad CO 2 på en gas-pad, sortera ut hanar och placera kvinnliga flyger in flaskor med standard eller behandling kost. Behåll kvinnliga flugor på experimentella dieter i 10 dagar.
- På tionde dagen efter eclosion och separation på experimentella dieter, flugor överföring från deras mat innehåller injektionsflaskor som injektionsflaskor innehållande en 5 ml kontakten på 2% agar och svälta dem för 12-16 h.
- Överföring svalt flyger till injektionsflaskor som innehåller 10% glukos indränkt filter för 1 timme före insulin injektion.
- Kortfattat Bedöva flyger med fuktad CO 2 efter glukos utfodring och sedan kalla immobilisera dem på is.
4. Injektionssättet
- Ta försiktigt tag i en kall immobiliserade flyga med ett par fina pincett och håll den nära nålspetsen så att spetsen ligger i anslutning till främre delen av den vänstra sidan av flugans bröstkorgen. Ta med både nålspetsen och flugans bröstkorgen i fokus under stereomikroskop.
- Rör försiktigt flyga mot nålspetsen så att nålspetsen rör vid mitten av förhöjning av vänster prescutum region i flugans bröstkorgen (figur 1). När flugan är rätt placerat och i linje med nålspetsen, vidareutvecklar flyga in nålen så att nålen spetsar mitten av prescutum.
- Applicera positivt tryck efter behov genom att främja sprutkolven med microinjector s mikromanipulator ratten tills 0,1 l vätska har injicerats i flugan. Flödet av vätska in i flugans hemocoel kommer att ge en blå färg på vänster sida av främre bröstkorgen. Ibland måste man dra tillbaka och gå flera gånger för att få bort eventuella stopp nålspetsen och möjliggöra strömning.
- Låt injiceras flyger återhämta sig under 2% agar injektionsflaskor för angivna tidpunkter innan hemolymph extraktion.
5. Hemolymph Kollektion
- Kortfattat söva flyger med fuktad CO 2 på önskat efter injektion tidpunkter och position varje flyga dorsal-och-ner på dubbelhäftande tejp som sitter på ytan av en CO 2-pad. Ordna flugor i jämna rader med huvudet i linje kapslar. Man kan använda ett trimmat trä applikatorpinne att trycka sina vingar i bandet limmet och se till immobilisering.
- När flugorna är fasta till bandet, ta tag varje flugans snabel med fina pincett och dra försiktigt ut den mot den ventrala och bakre region i flugan så att framsidan av huvudet kapsel är synlig genom lupp.
- Med den andra handen och samtidigt håller snabel på plats, hål i mitten av huvudet kapseln precis ovanför ptilinal suturen med en vass volfram nål (Fig. 2). Man måste vara noga med att inte in nålen för långt eftersom det är lätt att slå spetsen på nålen genom den andra sidan av huvudet kapsel och därefter förlorar CONTROLL AV hemolymph flöde. Punktering flyger allt i en injektion gruppen innan samla hemolymph.
- När huvudet kapseln har punkterat, använd ett trimmat trä applikator hålla sig till tryck försiktigt på flugan mage. Det kan vara bra att rulla flyga över så att den vilar på dess ventrala sida när man trycker. Detta förfarande kommer att producera en droppe hemolymph från huvudet kapseln punktionsstället.
- Tryck ena änden av en 1μl microcapillary röret till hemolymph droppe framkommit i huvudet kapseln punktionsstället. Den hemolymph kommer in i röret via kapillärkraften. Bestäm och redovisa det belopp hemolymph samlas genom att kontrollera den vätska kolumnen inom microcapillary röret mot en graderad volym diagram.
6. Hemolymph Glukos Fastställande
- Mata hemolymph prover i mikrotiterplatta brunnar innehåller 100 ìl av Infinity Glukos reagens. Håll plattan på is under lastning hemolymph prover.
- Upprätta en standardkurva genom att läsa in sig 1 l vardera glukoslösningar lager vid 50mm, 25mm, 12,5 mm, 6.25mM och 3.125mM.
- Inkubera prov vid 37 ° C i 10 minuter.
- Identifiera absorbans vid 340 nm.
- Konto för hemolymph volym samlas in och bestämma koncentration prov glukos baserad på standardkurva med kända glukos koncentrationer.
7. Representativa resultat
En typisk insulintoleranstest svar detekteras i insulin injiceras-flugor, där en nedgång i cirkulerande glukos nivåer upptäcks 15 minuter efter injektion. Däremot är dessa svar inte syns i PBS injiceras flugor (bild 3). Detta svar i perifert omhändertagande av glukos fortsätter insulin injiceras flyger upp till 30 minuter efter injektion. Vi extrakt rutinmässigt 0,2-0,5 ìl hemolymph per 4-5 flugor i varje injektion grupp. Tre injektion grupper ingår i varje försök.
Figur 1. Vänster sida av Drosophila thorax visar platsen nål insättning (Ändrad från Demerec, 1950) 7. För in nålen genom mitten av prescutum på den främre, dorsala region i vänster sida av bröstkorgen.
Figur 2. Framifrån Drosophila huvudet visar punktera plats för hemolymph utvinning (Ändrad från Demerec, 1950) 7. Punktering huvudet kapsel med en fint slipad volfram sond i mitten av huvudet kapseln precis ovanför ptilinal sutur.
Figur 3. En typisk insulintoleranstest svar detekteras i kontroll vuxna flugor. Kontroll w 1118 flugor injicerades med bovint insulin (1 ng i PBS) eller PBS bara. Flugor i replikera grupper har sedan möjlighet att återhämta sig efter 0, 15 eller 30 minuter och cirkulerande nivåer glukos mättes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniken beskrivs i denna rapport kan vara användbar i någon studie som undersöker fysiologiska processer som leder till mätbara förändringar i Drosophila hemolymph sammansättning. Genom att kombinera injektion och hemolymph samling på detta sätt är det möjligt att fastställa de omedelbara fysiologiskt relevanta effekter av en viss experimentell behandling eller manipulation. Den främsta fördelen med denna "åderlåtning" tekniken i hemolymph kollektionen jämfört med tidigare tekniker som innefattar halshuggning två är att denna teknik minimerar kontaminering av hemolymph prover med tarmen contents.If försiktighet vidtas för att inte samla in några pericerebral fett kroppens vävnader, vilket ibland kan uppträda i utstrålade hemolymph droppe, då prover bör noggrant återspegla in vivo cirkulationssystemet vätskor.
En potentiellt påverkande faktor inneboende i varje injektion experiment som utförs i denna skala är den första utspädning av det totala cirkulationssvikt vätska efter injektion. Detta kan lätt kontrolleras för, men genom att injicera samma volymer av PBS i experimentella flugor eller insulin i åldersmatchade kontroller och normalisering resultat. För att säkerställa reproducerbara cirkulerande glukosvärden, är kvaliteten på hemolymph droppar störst betydelse. Endast klara droppar av hemolymph saknar pericerebral fett kroppen eller annan vävnad skräp ska samlas in för glukos beslutsamhet. Det är också anmärkningsvärt att endast upp till 8 bör tas innan man kan avgöra den relativa glukos koncentrationer. Vi märkte en "drift" i OD 340 avläsningar när hemolymph proverna var kvar på isen under en längre tid.
Vår protokoll lämnar stort utrymme för modifiering baserat på tillgänglig utrustning. Pipettera avdragare inställningar kan behöva ändras enligt den modell och skick avdragare. Vi har funnit att inställningarna tillräcklig för att producera intracellulära nålar inspelning elektrod är idealiska för injektionsnålar. Dessutom, medan vi använde en treaxlig mikromanipulator för att upprätthålla nålläge under stereoskopet, kan detta också uppnås med ett kraftigt ringstand och klämma systemet som nålen kvar i ett fast läge under hela injektionen förfarandet. Den höga motstånd nålar används framtvingat en utveckling av en alternativ metod för att bestämma volymen av injicerade vätska som 01:01 sprutkolven rörelse till volym förskjutning inte var möjligt. Vi utvecklade en graderad skala som kan skrivas ut och fästas på sidan av nålen axeln. Beroende på vilket system som används kan det vara nödvändigt att tränga undan en del vätska från nålen bortom nålen innehavaren av microinjector så att vätskan menisken kan vara i linje med gradering kalibreringen kortet som sitter på sidan av nålen axeln.
Slutligen är två begränsningar av denna teknik noterades i våra protokoll. Först två personer vanligtvis krävs för att samordna både insprutning och hemolymph steg extraktionen för att maximera antalet behandlade prover. För det andra är variationer i insulintoleranstest svar ibland observerats inom samma genotyp. Vi tror att detta beror på varierande svar individuella flugor kan ha följande is immobilisering och återhämtning på agar. Därför bör ett tillräckligt antal prover skall undersökas innan säkra slutsatser kan dras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIA till YW.CF (AG21068, AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
