Summary
Оптическое разрешение ФА микроскопии (ИЛИ-PAM) является новая технология способна изображений оптического поглощения контрастов
Abstract
Оптическая микроскопия, предоставляя ценную информацию на клеточном уровне и органелл, получил широкое признание как позволяет биомедицинских технологий. Как опорой в естественных трехмерных (3-D) оптической микроскопии, single-/multi-photon флуоресцентной микроскопии и оптической когерентной томографии (ОКТ) продемонстрировали свою чрезвычайной чувствительностью к флуоресценции и рассеяния оптического контраста, соответственно. Тем не менее, оптический контраст поглощение биологическими тканями, который кодирует существенные физиологические / патологической информации, до сих пор не для оценки.
Появление биомедицинских фотоакустика привело к новой отрасли оптической микроскопии оптическим разрешением ФА микроскопии (ИЛИ-PAM) 1, где оптические облучения ориентирована на дифракционный предел для достижения сотовых 1 или даже 2 субклеточном уровне латерального разрешения. Как ценным дополнением к существующей оптической технологии микроскопии, ИЛИ-PAM вызывает, по крайней мере две новинки. Первое и самое главное, ИЛИ-PAM обнаруживает оптические контрасты поглощения с необычайной чувствительности (т.е. 100%). Объединение или-PAM с флуоресцентной микроскопии 3 или с оптико-рассеяния основан 4 октября (или с обоими) обеспечивает всестороннюю оптических свойств биологических тканей. Во-вторых, ИЛИ-PAM кодирует оптического поглощения в звуковые волны, в отличие от чистой оптических процессов в флуоресцентной микроскопии и октябре, а также предоставляет фоновом без обнаружения. Акустического обнаружения в ИЛИ-PAM смягчает воздействие оптического рассеяния от деградации сигнала и, естественно, исключает возможные помехи (например, перекрестных помех) между возбуждения и регистрации, что является распространенной проблемой в флуоресцентной микроскопии из-за перекрытия между возбуждения и флуоресценции.
Уникальный для оптических изображений поглощения, ИЛИ-PAM продемонстрировала широкой биомедицинских приложений с момента своего изобретения, в том числе, но не ограничиваясь, 5 неврологии, 6, офтальмологии, 7, 8, сосудистой биологии 9, 10 и дерматологии. В этом видео, мы учим, конфигурации системы и выравнивание ИЛИ-PAM, а также экспериментальные процедуры в естественных условиях функциональной визуализации микрососудов.
Protocol
1. Конфигурация системы
- Оптический облучения
- Оптический источник облучения: с диодной накачкой твердотельным импульсным лазером (INNOSLAB, Edgewave) и лазер на красителях (CBR-D, Сира).
- Выходной пучок лазера (длительность импульса: 7 нс), фокусируется линзой конденсатора (LA1131, Thorlabs), чтобы пройти через 50-мкм обскуры (P50C, Thorlabs).
- Отверстие находится немного в стороне от фокуса линзы конденсатора, чтобы соответствовать отверстие диаметром с основной моды диаметр пучка для эффективной пространственной фильтрации.
- Фильтруется луч ослабляется нейтральной плотности фильтра (NDC-50C-2М, Thorlabs), а затем вводится в одномодового оптического волокна (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
- Выход волокна заполняет заднюю апертуру объектива микроскопа (RMS4X, Thorlabs) для достижения дифракционного оптического фокуса ~ 2,6 мкм при длине волны 570 нм.
- Ультразвуковая
- Ультразвуковой датчик: 50-МГц центральная частота (V214-BB-РМ, Olympus-NDT).
- Ультразвуковой датчик прикреплен к самодельной акустической оптический луч комбайнером 11 для ультразвукового обнаружения, которые выравнивается соосно с дифракционной оптического облучения.
- Сферической полости земли из нижней части комбайнера для производства акустических линз. Это акустическая линза имеет числовой апертурой 0,5 в воде и дает акустический координационного диаметром 43 мкм на 50-МГц центральным.
- Оптические и акустические фокусы выравниваются confocally максимально чувствительность обнаружения.
- Акустическая связь
- Сухой ультразвуковой связи используется, чтобы избежать погружения экспериментальных животных в воде, которая была использована в начале фотоакустической систем визуализации 12.
- Визуализации окно открывается в нижней части чашки Петри (9 см в диаметре) и уплотняется ультразвуковым и оптически прозрачной оболочкой из полиэтилена.
- Ультразвуковой гель (Clear Image, SonoTech) между мембраной полиэтилена и объектов для включения в образ пары сгенерированных фотоакустической волны от объекта в чашке Петри, и деионизированной воды в чашке Петри дальнейшего пары волны погружения ИЛИ-PAM голову изображений .
- Электроника
- ФА сигнал обнаружен ультразвукового преобразователя усиливается два каскадных усилителей (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
- Усиленный сигнал оцифровывается 14-битным сбора данных (DAQ) пансион (CompuScope 14200, Gage Applied Sciences) при частоте дискретизации 200 MS / s.
- Схема сканирования
- Двумерные (2-D) растровых сканирование ИЛИ-PAM изображения головы вдоль горизонтальной плоскости (ху) управляется персональным компьютером, который вызывает как плата DAQ и лазера накачки. Запускающий сигнал синхронизируется с часами-аута от платы ввода-вывода.
- Быстро оси 2-D сканеров определяется как направление поперечного сечения сканирования (В-сканирование).
- Последовательность В-сканирование изображений может быть приобретено путем перевода изображений головой вдоль медленной оси, чтобы сформировать объемные изображения, которые могут быть просмотрены либо в прямой 3-D рендеринга или в 2-D Максимальная амплитуда проекции (MAP) изображение .
2. Система выравнивания
- Использование эхо-ультразвука и ультразвуковой отражателя, чтобы определить положение акустических фокальной плоскости (т. е. время задержки от сигнала запуска до максимального эхо-ультразвукового сигнала). Этот шаг необходимо проделать только один раз при создании ИЛИ-PAM системы.
- Максимальная эффективность связи одномодового волокна.
- Применение ультразвуковой гель на вершине оптически поглощающих объекта (например, кусок черной лентой) и аккуратно прикрепить его под изображения окна в чашке Петри заполнена деионизированной водой.
- Нижняя изображений головой в воду, и удалить пузырьки воздуха в ловушку под акустические линзы.
- Настройка изображения головы, пока фотоакустического сигнала поглощающего объекта от акустических фокальной плоскости, о чем можно судить из акустической задержки.
- Отрегулируйте вертикальное положение (например, г позицию) объектива микроскопа максимально амплитуды ФА-сигнала, генерируемого с плоским предметом. Максимальной амплитуды сигнала о том, что оптический фокус в соответствие с акустическими фокус в вертикальном направлении.
- Отрегулируйте горизонтальном положении (то есть, х и у позиции) объектива микроскопа до фотоакустической сигнал, генерируемый из целевого показывает симметричной картины. Симметрии позволяет предположить, что оптический фокус в соответствие с акустическими фокус в горизонтальном направлении.
- Повторите шаги 2,6 и 2,7 до фотоакустического сигнала оптимизирована как симметрия и амплитудой.
3. Са mple экспериментальной процедуры, в естественных условиях ИЛИ-PAM из уха мыши сосудистую
- Этот шаг не является обязательным для голых мышей. Обезболить животное с внутрибрюшинного введения коктейль [рецепт: 1 мл кетамина (100 мг / мл), 0,1 мл ксилазина (100 мг / мл), и 8,9 мл физиологического раствора; доза: 0,1 мл на 10 г]. Бритье волос в ухе, а в дальнейшем удалять волосы остаточные волосы Surgi крем (Категория #: 82565, American International Industries) перед чисткой деионизированной водой. Обратите внимание, что такая эпиляция может слегка раздражать кожу сосудистую и, таким образом лучше всего проводить за 24 часа до планируемого эксперимента.
- Включите фотоакустической лазерной системы, а также проверить системы выравнивания.
- Обезболить мышь с 3% ИФ испаряется при вдыхании газа (типичный расход 1,0-1,5 л / мин, в зависимости от массы тела животного), и поддерживать анестезии с 1% изофлуран течение всего эксперимента. Медико-класса воздух рекомендуется как вдыхание газа для поддержания мыши на нормальные физиологические состояния.
- Передача мыши стереотаксической этапе, и контролировать ее температуру тела при температуре 37 ° С грелку.
- Свести уха мыши на пластиковую пластину и нанесите слой ультразвука гель в верхней части уха. Избежать захвата пузырьков воздуха внутри геля. Затем, место под ухом визуализации окна и медленно поднимите животной стадии до ультразвуковой гель контакты нижней части полиэтиленовой оболочкой. Мягкие контакта необходимо, так как нажатие ухо к мембрана может повлиять на приток крови в ухе.
- Зажим пульсоксиметр для ног или хвоста мыши, чтобы следить за его физиологического состояния, а также применять мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость и случайного повреждения лазерных мышей глаза.
- Нижняя изображения головы, пока акустические линзы погружают в деионизованной воде и удалить пузырьки воздуха в ловушку под акустические линзы.
- Проверьте лазерной энергии, чтобы убедиться, что она находится в пределах лазерной безопасности стандартам Американского национального института стандартов 13. Лазерной энергии не должна превышать 20 мДж / см 2, что означает 80 нДж от энергии лазерного импульса, когда лазерный луч фокусируется на 150 мкм под поверхностью кожи.
- Установить лазер внешнего триггера режима и начать судебный процесс сканирования. Отрегулируйте положение г изображения головы, пока сильные фотоакустической сигнал от акустического фокальной плоскости.
- Установите правильные параметры сканирования и начать формальное захвата изображений.
- После эксперимента, выключите лазер, поднимите изображений голову из деионизированной воды, ниже животной стадии, чтобы освободить мышь, чистый уха мыши деионизированной воды, выключить систему анестезии и регулятор температуры, и выгружать мыши от стереотаксической стадии.
- Если повторяющихся изображений не требуется, положить мышь в инкубатор с температуры окружающей среды установлен на уровне 37 ° C. Вернуться мыши животных объекта после его просыпается естественным путем. В противном случае следуйте животных протоколов euthanatize и распоряжаться им.
4. Функциональные ИЛИ-PAM общего содержания и насыщения кислородом гемоглобина
- Оксигемоглобина (HBO 2) и дезоксигемоглобин (HBR) являются двумя основными формами гемоглобина, преобладающим эндогенных фотоакустической источник в видимой области спектра. HBO 2 и HBR имеют различные оптические спектры поглощения и, следовательно, могут быть дифференцированы спектрально количественно как общая концентрация (HBT) и насыщения крови кислородом (SO 2) гемоглобина 5. Вот две рекомендации, которые помогут выбрать правильный оптических длин волн для SO 2 измерения:
- Длины волн должны быть выбраны в Q-диапазоне спектра поглощения гемоглобина (например, 550-600 нм), чтобы обеспечить достаточный сигнал-шум и адекватного проникновения.
- Длины волн, где коэффициенты поглощения HBO 2 и HBR есть сильное различие (например, HBR-доминирующей 561 нм и HBO 2-доминирующей 578 нм) рекомендуется.
Кроме того SO 2, HBT может быть рассчитана, добавляя [HBR] и [HBO 2] вместе, или он может быть измерен при длине волны изобестической молярной спектры коэффициента ослабления гемоглобина (например, 530 нм, 545 нм, 570 нм, а 584 нм) 14, где HBR и HBO 2 имеют равные молярные коэффициенты погашения.
5. Представитель Результаты:
Показанный на рисунке 1 сосудистой анатомии и SO 2 в живой обнаженной уха мыши изображено двойной длины волны (561 и 570 нм) или-PAM. Типичное время захвата изображений для двухволновой SO 2 измерения такой области, представляющие интерес (размер: 10 мм х 10 мм с шагом: 2,5 мкм и длиной 5 мкм) составляет ~ 80 мин.
p_upload/2729/2729fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. В естественных условиях оптического разрешения ФА микроскопии. КАРТА изображения (А) общей концентрации гемоглобина показывает сосудистой анатомии (приобретенные при 570 нм) и (б) насыщение гемоглобина кислородом (приобретенных на 561 нм и 570 нм) в обнаженном уха мыши. (C) Крупный план коробку региона в панели (). Шкалы на графике () относится как к (А) и (Б).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео, мы предоставляем подробную инструкцию по экспериментальным протоколам ИЛИ-PAM, включая конфигурацию системы, системы выравнивания и типичных экспериментальных процедур. Этикетка-свободной, неинвазивный ИЛИ-PAM позволила исследования микрососудистых функционирования и обмена веществ на одном капиллярной основе и тем самым имеет потенциал, чтобы расширить наше понимание микроциркуляции связанных физиологии и патологии. Microphotoacoustics в настоящее время производство этой ИЛИ-PAM системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все экспериментальные процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом лабораторных животных утвержденной школы медицины Исследования на животных комитета Вашингтонского университета в Сент-Луисе.
Acknowledgments
Авторы ценят внимательное чтение доктор Lynnea Брамбо рукописи. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грантов R01 EB000712, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 и 5P60 DK02057933. Профессор Lihong В. Ван финансовой заинтересованности в Microphotoacoustics, Inc и Endra, Inc, которая, однако, не поддержали эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Home-made acoustic-optical beam combiner: | |||
| right-angle prism | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| rhomboid prism | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| silicone oil | Clearco Products | 1000cSt | |
| OR-PAM system | Microphotoacoustics | ||
References
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).
- Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo. Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).
- Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).
- Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).
- Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V.
- Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).
- Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence. Blood. , Forthcoming Forthcoming.
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).
- Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).
- Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136. , American National Standards Institute Inc. New York, NY. (2007).
- Jacques, S. L., Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin . Oregon Medical Laser Center [Internet]. , Available from: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html (1999).
