Summary
Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.
Abstract
Infecções virais causar morbidade e mortalidade em transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) destinatários. Nós e os outros têm gerado com sucesso e infundida células T específicas para Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e adenovírus (Adv), utilizando monócitos e células EBV-transformadas linfoblastóides (EBV-LCL) gene modificado com um vetor de adenovírus como células apresentadoras de antígenos (APCs). Sómente 2x10 5 / kg trivirus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) proliferaram por vários registros após a infusão e apareceu para prevenir e tratar a doença viral grave ainda resistentes a outras terapias disponíveis. Quanto mais ampla a implementação desta abordagem é limitada pela encorajando altos custos de produção, a complexidade de produção e tempo prolongado (4-6 semanas para EBV-LCL geração, e 4-8 semanas para a fabricação de CTL - total 10-14 semanas) para a preparação. Para superar essas limitações, temos desenvolvido um novo protocolo de GMP-compliant produção CTL. Em primeiro lugar, no lugar de adenovectors para estimular as células T que usamos células dendríticas (DCs) nucleofected com DNA de codificação de plasmídeos LMP2, EBNA1 e BZLF1 (EBV), hexon e Penton (Adv), e pp65 e IE1 (CMV), como apresentadoras de antígenos células. Estes APCs reativar células T específicas para todos os antígenos estimulante. Cultura, segundo células T ativadas na presença de IL-4 (1000 U / ml) e IL-7 (10ng/ml) aumenta e sustenta o repertório ea freqüência de células T específicas em nossas linhas. Terceiro, temos utilizado um novo dispositivo de cultura de gás permeável (G-Rex), que promove a expansão ea sobrevivência de números de grandes células, após um estímulo único, eliminando assim a necessidade de EBV-LCLS e reduzindo a intervenção do técnico. Ao implementar essas mudanças nós podemos agora produzir CTL multiespecífico segmentação EBV, CMV, e Adv, a um custo por 10 6 células que é reduzida em> 90%, e em apenas 10 dias em vez de 10 semanas, utilizando uma abordagem que pode ser alargado a mais proteção antígenos virais. Nossa abordagem FDA-approved deve ser de valor para aplicações profiláticas e de tratamento para os destinatários de alto risco HSCT alogênico.
Protocol
1. Nucleofection DC
- Colheita derivados de monócitos DCs, que foram enriquecidas com a adesão de plástico, cultivadas por cinco dias usando celular Genix Mídia suplementado com IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) e ainda venceu por 24 horas usando a maturação citocinas IL4 DC (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml e PGE2 (1μg/ml) 1, pela ressuspensão gentil com uma pipeta de 3 ml.
- Contar DCs viável usando azul de tripano, transferência para tubos 15ml 3x com nada menos que 0.5x10 6 e não mais do que 2x10 6 células / tubo.
- Centrífuga DCs para 10mins @ 200g. Durante este período pré-aquecer celular Genix meio suplementado com as citocinas maturação DC (DC meios de maturação) - 2ml/well em três poços de uma cultura de tecidos de 12 bem tratado em uma placa de 37 ° C / 5% CO 2 incubadora.
- Uma vez que células terminar spinning, aspirar o sobrenadante e adicionar os plasmídeos DNA relevantes para cada um dos tubos em uma concentração final de DNA 5μg / tubo. Neste caso, adicione o plasmídeo IE1-pp65 ao tubo n º 1, hexon-Penton ao tubo # 2, e EBNA1-LMP2-BZLF1 ao tubo n º 3.
- Ressuspender DCs e DNA com 100μl de solução Amaxa nucloefection, misture bem e transferir para o cubetas nucleofection.
- Cubetas lugar no nucleofector 4D, escolher programa CB150 (Amaxa / Lonza), e pressione o começo.
- Imediatamente após nucleofection adicionar 500μl do 2ml pré-aquecido celular Genix meio de maturação DC para a cubeta, misturar suavemente por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes, e DCs nucleofected transferência para a chapa 12 bem preparados contendo os 1,5 ml restantes de pré-aquecida maturação media DC. Transferência para a 37 ° C / 5% CO 2 incubadora por mais 12-18hrs.
2. Estimulação das células T
- Colheita e contagem de DCs nucleofected, e irradiar a 30Gy. Lavar uma vez com 10ml de meio de CTL (45% RPMI, Cliques 45% EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) e @ 3 ressuspender x 10 5 DCs por ml de mídia CTL.
- Piscina um mínimo de 7.5x10 5 (2,5 ml) e um máximo de 15x10 5 (5ml) de DCs contendo cada um dos plasmídeos e transferir os DCs agrupados ao dispositivo G-Rex, que será então colocado na incubadora.
- Para a preparação de células de resposta usar PBMCs anteriormente congelados ou não aderente células mononucleares que permanecem após a seleção DC (adesão ou CD14 seleção). Descongelar as células, a transferência para meio de cultura pré-aquecida, lave uma vez com a mídia CTL. Ressuspender as células em Media CTL, a contagem das células e levá-los a uma concentração de 2x10 6 células por ml. Leve 15x10 6 células ou 7.5ml e suplementar com 30000U IL4 (1000U/ml -. Conc final) e 300ng IL7 (10ng/ml - conc final.).
- Transferência 7.5ml de PBMC (15x10 6 células) para o G-Rex e superior até o biorreator com a mídia CTL para um volume total de 30ml.
- Cultura do G-Rex por 6-7 dias a 37 ° C / 5% CO 2 incubadora umidificada.
3. T expansão celular
- No dia 07/06, aspirar 10ml de mídia, então misturar as células do 20ml restantes de mídia com uma pipeta de 10 ml e contagem de células viáveis com azul de tripano. Se houver <50x10 6 repor com novas mídias + citocinas. Se houver> 50x10 6 células remover 10ml de suspensão celular, a transferência para um novo G-Rex, e depois alimentar tanto G-Rexs com novas mídias CTL + citocinas.
- Cultura para um adicional de 4-6 dias. Uma vez que células suficientes foram ampliados, realizar uma caracterização fenotípica e funcional do excesso de CTL e criopreservar para uso futuro.
4. Resultados representativos:
Um esquema de nosso FDA-approved processo de geração de multivirus específicas CTL é mostrado na Figura 1. Em contraste com protocolos convenção multivirus CTL que usam adenovectors e EBV-LCL para estimular as células-vírus reativa T 2 temos substituído material de vírus infeccioso com plasmídeos DNA que codificam antígenos derivados de cada um dos três vírus. Para estimular a CTL trivirus nós projetamos três multicistronic plasmídeos codificando hexon e Penton de adenovírus, IE1 e pp65 do CMV, e EBNA1, LMP2, e BZLF1 de EBV. Estes antígenos foram escolhidos com base em resultados encorajadores clínica de nossas próprias e de outros grupos mostrando que as células T dirigidos contra Adv-hexon e Penton 2,4-6, e CMV-1E1 e CMV pp65-são protetores in vivo 7. Para EBV, EBNA1 é um CD4 + T imunodominantes antígeno alvo celular expressa em todas as neoplasias malignas associadas ao EBV e em células normais infectadas pelo EBV B 8,9, LMP2 é imunogênica em vários tipos de HLA múltiplas e expressa na maioria dos tumores malignos EBV, 10,11 enquanto BZLF1 codifica uma imunodominantes, antígeno precoce imediato ciclo lítico que estimula tanto CD4 + e CD8 + T da maioria dos indivíduos e é provável que importantes para o control de células replicação do vírus 12. Para otimizar ainda mais os nossos métodos de fabricação que colaborou com Tecnologia Nature que gerou minimizado, sem antibiótico (FDA-compliant) plasmídeos para a estimulação CTL 13,14. Usando esta estratégia que consistentemente alcançar eficiências nucleofection de> 35%, mantendo a viabilidade das células de alta (dados não mostrados) 3. A Figura 2 mostra que a freqüência de células T-vírus específico em resposta a cosmídeos otimizado medida pelo IFNγ ELISPOT, foi maior que em resposta a convencional plasmídeos pShuttle baseado expressão expressando os mesmos antígenos (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV e EBV n = 2). O melhor rácio de DC: PBMC foi importante para a estimulação das células T potente como mostrado na Figura 3, onde uma proporção de 1:50 produzidos sub-ótimo de ativação em comparação com um S 1:20: R ratio (n = 2 doadores). Produção de suficientes números CTL com a especificidade do antígeno larga é um pré-requisito para a eficácia clínica contra os três vírus. Isto é conseguido pela cultura CTL no G-Rex, que apóia a expansão de células T superiores quando comparados com os placas de 24 poços (Figura 4A) 15, enquanto a adição de IL4 e IL7 a aumentos culturas do repertório e especificidade, como mostrado na Figura 4B onde a freqüência de células T reativas contra o CMV-pp65 derivados HLA-A2 RESTRIÇÕES NLV peptídeo foi avaliada em culturas gerado na presença ou ausência de IL4 e / ou IL7 16,17. Para avaliar a capacidade fenótipo e funcional das células expandidas realizamos análise de citometria de fluxo, intracelular de citocinas coloração / IFNγ ELISPOT, e 51 testes de liberação de Cr sobre o produto final para a criopreservação / perfusão. Normalmente as células geradas são policlonais com uma população mista de células CD4 + e CD8 + T com antígeno especificidade detectáveis nos dois compartimentos da célula T. O CTL são capazes de matar antígeno viral expressando as células-alvo, mas não do vírus negativos parcialmente HLA alvos combinados, indicando que eles não devem induzir enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) in vivo (Figura 5).
Figura 1. Rctl protocolo geração. Primeiro, DCs são nucleofected com o antígeno viral codificação de plasmídeos e então misturado com PBMCs autólogo em um R: S de 10 ou 20:1. Células são expandidas no G-Rex por 10-14 dias, na presença de IL4 e IL7, então colhidos, contados, testado para a identidade de função, e esterilidade, e depois criopreservados para uso clínico.
Figura 2. Cosmídeos Optimized induzem ativação de células T in vitro superiores. DCs foram nucleofected com otimizado, FDA-compliant plasmídeos codificando hexon e Penton (Adv), IE1 e pp65 (CMV), e EBNA1, LMP2, e BZLF1 (EBV) ou plasmídeos pShuttle convencionais de codificação os mesmos antígenos. Estes foram usados para estimular as células T e especificidade foi analisada pelo IFNγ ELISPOT 10 dias pós-estimulação.
Figura 3 DC ideal:. Proporções de células T para a ativação do CTL. DCs de 2 doadores foram nucleofected com todos os três plasmídeos otimizado e, em seguida, utilizado para estimular PBMCs autólogo em 1:20 ou 1:50 DC: relação de PBMC. A freqüência de células T reativada foi avaliada no dia 10 de IFNγ ELISPOT.
Figura 4. Expansão de células T no G-Rex usando citocinas melhorando. Um painel mostra o dispositivo G-Rex, bem como aparência CTL na membrana gás permeável, avaliados por microscopia. Uma comparação entre a saída de células alcançado na convenção de cultura de tecidos tratados placas vs G-Rex também é mostrada. Painel B mostra a freqüência de CMV CTL pentâmero positivos alcançados nas culturas expandiu na presença de nenhum de citocinas, IL4 sozinho, IL7 sozinho e IL4 + IL7.
Figura 5. Fenótipo e função de CTL expandida. Um painel mostra um exemplo representativo do fenótipo do CTL multivirus expandido, que são policlonais com uma mistura de CD4 + (45% - helper) e CD8 + (42% - citotóxicos), as células T, dos quais a maioria (95%) expressou o memória marcador CD45RO + / CD62L + Panel. B mostra que essas células são específicos para todos os antígenos estimulante e são polifuncionais, avaliada pela coloração de citocinas intracelulares para detectar a produção de IFNΓ e TNFa após a estimulação antigênica. Painel C mostra que a CTL expandida são funcionais medida por Cr ensaio 51. Autólogo LCL, sozinho ou transduzidas com um vetor nulo ou um vetor adenoviral expressando-CMV pp65 foram usados como alcatrãofica. Alloreactivity foi avaliada através explosões alogênico PHA como um alvo.
Discussion
Infecções virais são responsáveis por significativa morbidade e mortalidade em pacientes que são imunocomprometidos por sua doença ou seu tratamento. Após o transplante, por exemplo, infecções causadas por herpesvírus persistentes, como EBV e CMV, bem como por vírus respiratórios, tais como Vírus Sincicial Respiratório (VSR), são bem conhecidos, enquanto a importância de infecções causadas por Adv, vírus BK, e humanos herpesvirus (HHV) -6 tem mais recentemente sido apreciado. Enquanto agentes farmacológicos são a terapia padrão para algumas infecções, eles têm toxicidade substancial, gerar variantes resistentes, e são frequentemente ineficazes. Em contraste, as células T-vírus específicos derivados de doadores de células-tronco se mostraram seguros e eficazes para a prevenção e tratamento da infecção viral ou doença no transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) definição 2,5,6,18-21. No entanto, a mais ampla implementação de T imunoterapia celular é finalmente limitado pelo custo, complexidade e tempo necessário para a produção de CTL.
Nosso romance e uma abordagem rápida para gerar multivirus CTL, descrito no manuscrito atual, deve aumentar substancialmente a possibilidade de terapia com células T citotóxicas para doenças virais, permitindo que a estratégia para se tornar um padrão de atendimento para o hospedeiro imunocomprometido. O uso de plasmídeos DCs nucleofected como APCs permite apresentação de antígenos em ambos MHC classe I e II sem a concorrência de vetores virais ou mesmo de vários antígenos virais sendo expresso em uma única célula desde diferentes populações DC são utilizados para cada três plasmídeo. O uso de IL-4 / 7 aumenta a sobrevida das células T e proliferação, o que ajuda a aumentar correspondentemente a freqüência eo repertório de responder células T antígeno-específicos 16,17. Finalmente, a cultura no G-Rex reduz drasticamente a apoptose de células T durante a cultura. Troca gasosa (O 2 e CO 2) ocorre através de uma membrana de silício de gás permeáveis na base do frasco, evitando a hipóxia, permitindo uma maior profundidade de médio acima das células, fornecendo mais nutrientes e diluição de resíduos. Esta plataforma também pode ser estendido aos vírus adicionais como quando antígenos protetores são identificados.
Disclosures
Juan F. Vera é um consultor de Wilson Manufacturing Wolf. Os outros autores não têm divulgações relevantes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por uma assistência de produção de terapias celulares (contrato NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), uma Centros Especializados de Terapia Celular Grant NIH-NHLBI uma U54 HL081007 (CMR), uma ASBMT Young Investigator Award (UG e JV), um Fellow da Sociedade Leucemia e Linfoma especial em Prêmio Pesquisa Clínica (UG), e uma Amy Strelzer Scholar Award Manasevit (AML).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CellGenix | CellGenix | 2005 | |
IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
Human AB serum | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
Nucleofection Kit | Amaxa | V4XP-3012 | |
Plasmids | NTC | n/a | |
GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
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