Summary
Vi beskriver här en metod för biopsying olfactory slemhinna från råttor och människor näshålan. Dessa biopsier kan användas antingen för att identifiera molekylära avvikelser i hjärnans sjukdomar eller isolera multipotenta adulta stamceller, som kan utnyttjas för celltransplantation i djurmodeller av hjärnan trauma / sjukdom.
Abstract
Den lukt slemhinnor, som ligger i näshålan, är ansvarig för att upptäcka lukter. Det är också den enda nervvävnad som utsätts för den yttre miljön och lättillgängliga i varje levande individ. Som ett resultat, är denna vävnad unikt för någon syfte att identifiera molekylära avvikelser i patologiska hjärnan eller isolera adulta stamceller för cellterapi.
Molekylära avvikelser i hjärnans sjukdomar är ofta studeras med hjälp av nervvävnad prover som tagits efter slakt. Emellertid har detta material antal begränsningar. Däremot är det luktsinnet slemhinnan lättillgänglig och kan man ta biopsier ifrån säkert utan någon förlust av luktsinnet 1. Därför ger luktsinnet slemhinnan ett "öppet fönster" i den vuxna människans genom vilken man kan studera utveckling (t.ex. autism, schizofreni) 2-4 eller neurodegenerativa (t.ex. Parkinson, Alzheimer) sjukdomar 4,5. Olfactory slemhinna kan användas för antingen jämförande molekylära studier 4,6 eller in vitro-försök på neurogenes 3,7.
Den luktepitel är också en nervvävnad som producerar nya nervceller varje dag för att ersätta dem som skadas av föroreningar, bakterier av virusinfektioner. Denna ständiga neurogenes upprätthålls av stamceller, men också stamceller som är bosatta inom både fack i slemhinnan, nämligen neuroepithelium och den underliggande lamina propria 8-10. Vi nyligen utvecklat en metod för att rena den vuxna stamceller som finns i lamina propria och efter att ha visat att de är närstående till benmärgen mesenkymala stamceller (BM-MSC), heter vi dem lukt Ecto-mesenkymala stamceller (OE- MSC) 11.
Intressant, jämfört med BM-MSC, OE-MSC visa en hög spridning takt, en förhöjd clonogenicity och en benägenhet att differentieras till neurala celler. Vi drog fördel av dessa egenskaper för att utföra studier tillägnad avtäcka nya gener vid schizofreni och Parkinsons sjukdom 4. Vi och andra har också visat att OE-MSC är lovande kandidater för cellterapi, efter en ryggmärgen trauma 12,13, ett cochlea skada 14 eller i en djurmodeller av Parkinsons sjukdom 15 eller minnesförlust 16.
I denna studie presenterar vi metoder för att biopsi lukt slemhinna hos råtta och människa. Efter samlingen är lamina propria enzymatiskt separeras från epitel och stamceller renas med hjälp av en enzymatisk eller en icke-enzymatisk metod. Renat lukt stamceller kan sedan antingen odlas i stora antal och bankas i flytande kväve eller förmås att bilda sfärer eller differentieras till neurala celler. Dessa stamceller kan också användas för jämförande omik (genomisk, transcriptomic, epigenomiska, proteomik) studier.
Protocol
1. Insamling av Olfactory Mucosa hos råttor
- Börja med att förbereda tre 35 mm petriskålar fyllda med DMEM / HAM F12 odlingsmedium i en ren kultur huva.
- Alla metoder för dödshjälp måste godkännas i förväg av institutionens djurvård och använda kommittén och utföras av behörig personal. När råttan har gått in djupt anestesi med natrium pentobarbital eller andra injicerbara former av anestesi, såsom ketamin / xylazin, halshugga och ta bort skinnet. Inhalant anestetika bör undvikas. Lämpligheten av anestesi kommer att bedömas av toe pinch före halshuggning. Ta bort underkäken med sax och med hjälp av en rongeur, eliminera ansiktsmusklerna på båda sidor.
- Från baksidan av framtänderna, bort med en rongeur benet täcker näshålan, en sida i taget. Den lukt näsmusslan komma i sikte som orange / bruna organ sitter på baksidan av näsan.
- Fint kassera näsmusslan med en pincett. Med hjälp av en 26 gauge kanyl, isolera luktsinnet slemhinnan som låg på septum genom att skära vävnaden längs tre linjer: den båge av den vinkelräta plåten, det cribriform plattan och taket i näshålan.
- Samla biopsier på båda sidor och överföra dem i en DMEM / HAM F12-fyllda petriskål. Detta förfarande bör inte ta längre än 10 minuter från början dödshjälp.
- Nu, i syfte att avlägsna slem, överföra biopsier två gånger i medelstora fyllda petriskålar.
2. Insamling av Olfactory Mucosa hos människa
- Detta förfarande bör utföras av en öron-näsa-hals (ÖNH) kirurg, i enlighet med relevanta lokala etiska kommittén (s), och varje öppenvård bör underteckna ett informerat samtycke.
- Med hjälp av en 0 ° eller 30 ° stela endoskop (4 mm diameter), inspektera både näshålan och bedöma den förmodade förekomsten av polyper eller inflammatoriska lesioner. Välj det bästa näshålan, med hänsyn till avvikelsen mellan septum.
- Använda en bomull applikator, tillämpa en lokalbedövning, såsom lidokain med adrenalin, i 10 minuter.
- Med en throughcut ethmoid pincett, samla en två kvadratmillimeter biopsi antingen vid roten av den mediala aspekten av mitt turbinata eller på septum i dorsomedial området.
- Den lukt biopsi överförs sedan, med en steril nål i en steril 2 ml rör fyllt med 1 ml DMEM / HAM F12. Tips röret upp och ner för att se till att biopsi är nedsänkt i odlingsmedium.
- Sätt röret i kyld behållare och transportera det till forskningslaboratorium. I detta skede kan biopsi användas per se för jämförande molekylära studier inriktade på särskilda sjukdomar i hjärnan eller bearbetas för att generera stamceller.
3. Isolering av Olfactory stamceller från mänskliga och Rat Mucosa
- Tvätta biopsier i DMEM / HAM F12. Inkubera biopsier i en petriskål fylld med 1 ml dispase II-lösning (2,4 IE / ml) i 1 timme vid 37 ° C.
- Nästa, under ett dissekera mikroskop med en brytas inverterad ljus är luktepitel bort från den underliggande lamina propria med hjälp av en mikro spatel.
- Den luktepitel är tunnare och ser genomskinlig över en svart bakgrund jämfört med lamina propria som är randig orange / brun. Över en vit bakgrund, ser epitelet grå och lamina propria, brun.
- När renad, överföra lamina propria i en petriskål fylld med DMEM / HAM F12.
- Om vävnaden är från en gnagare, klipp av lamina propria i små bitar med två 25 gauge nålar. Sedan överför bitarna till ett 15 ml rör fyllt med 1 ml kollagenas IA.
- I röret med en steril plastpipetten, dissociera vävnaden. Sedan inkubera röret i 10 minuter vid 37 ° C.
- För att avsluta dissociation, skaka röret och tillsätt 9 ml av Ca-fri och Mg-fri PBS och centrifugera vid 200 gi 5 minuter.
- Resuspendera cellpelleten i DMEM / HAM F12 odlingsmedium kompletteras med 10% fetalt kalvserum, antibiotika och plåt på plast kultur rätter.
- Nu, om vävnaden är mänskligt, sedan skiva lamina propria i 3 till 4 delar med en tjocklek från 200 till 500 ìm.
- Sätt varje remsa i sin egen 2 cm diameter kultur skål och täck vävnaden med steril 1,3 glas cm diameter täckglas.
- Lägg sedan till 500 l odlingssubstrat (DMEM / HAM F12 kompletteras med 10% fetalt kalvserum och antibiotika) att varje kultur rätt.
- För antingen vävnadstyp, förnya odlingsmedium var 2 till 3 dagar.
- Fem till sju dagar efter kommer stamceller att börja invadera kulturen skålen och efter två veckor de ska konfluenta. När confluency nås, passage och överföra celler till kultur kolvar.
4. Sfären Bildning och Neuronal differentiation av Olfactory stamceller
- För att generera sfärer stamceller, inkubera kolvarna i två timmar vid 37 ° C med poly-L-lysin. (Text: 5 g/cm2).
- Tavla av celler med en täthet av 16.000 celler per kvadratcentimeter i det behandlade kolvar.
- Varannan dag, mata cellerna med 0.2ml per kvadratcentimeter av kompletterad medium (DMEM / HAM F12 kompletteras med insulin, transferrin, selen (ITS-X, 1%), fonden (50 ng / ml) och FGF2 (50 ng / ml)).
- Två till fem dagar senare, samla in flytande cell sfärer och antingen re-platta eller separera dem innan ympning i djurmodeller av cellterapi.
- För att skilja lukt stamceller till neuron-liknande celler, odla dem i 21 dagar i Neurobasal medium som innehåller B-27, penicillin, streptomycin, glutamin och glutamat.
- Gör sedan mediet förändras varje 3 dagar. Neuron-liknande celler som ska visas efter två till tre veckor.
5. Representativa resultat:
Nasal mänskliga Explantation-var större än stamceller (Figur 2A) delar sig snabbt och confluency kan nås inom en till två veckor. Ett viktigt inslag i stemness, nestin uttryck, har utvärderats (Figur 2B). När odlas på poly-L-lysin med serumfritt odlingsmedium kompletteras med EGF (50 ng / ml) och FGF2 (50 ng / ml), lukt stamceller ger upphov till områden (figur 2C). När odlas i serum innehållande odlingsmedium nyligen pläterade kulor ge upphov till GFAP-uttryckande celler (~ 50%), tubulin-innehållande celler (~ 10-15%) och O4-innehållande celler (~ 2-5%) 9 (Siffror 2D-F). Däremot kan det öde området som härrör från celler ändras. Till exempel, när den odlas i ett Neurobasal odlingsmedium kompletterat med B27 och glutamat, de flesta av näsans luktsinnet stamceller till neuron-liknande celler som uttrycker β-III-tubulin (Figur 2G) och MAP2 (Figur 2H).
Figur 1. Övergripande system av försöket. Lukt slemhinna biopsier är utskurna från råtta eller människa näshålan. Explants kan användas i sig för jämförande molekylära studier som syftar till att identifiera biomarkörer i hjärnans sjukdomar. För att isolera lukt stamceller, är samspelet mellan lamina propria och neuro-epitelet störd med dispase II enzymet och efter 45 minuter är epitel bort med en mikro-spatel. Gnagare lukt stamceller är ytterligare väljs av isär den lamina propria med kollagenas IA. För mänsklig vävnad, är bitar av luktsinnet lamina propria odlade under glas täckglas fram var större än stamceller invadera hela väl. Efter spridning, med ett lämpligt odlingsmedium kan luktsinnet stamceller generera sfärer eller differentiera till neuron-liknande celler. Lukt stamceller kan användas för att i) reparera hjärnan sjukdomar eller trauma eller ii) identifiera molekylära markörer för sjukdomar i centrala nervsystemet. Illustrationer är gjorda med hjälp av Servier medicinsk art.
Figur 2. Kultur och differentiering av nasal mänskliga luktsinnet stamceller. Mänskliga stamceller växer ut från lamina propria Explantation (A) som delar snabbt, vid odlas i ett serum som innehåller medium. Stamceller uttrycker stemness markören nestin (B). När pläterade på poly-L-lysin-belagda plast och odlas i ett serumfritt odlingsmedium kompletteras med fonden och FGF2, lukt stamceller generera sfärer (C). Sphere-härledda celler, när pläterade i serum innehållande odlingsmedium, ger upphov till GFAP-uttryckande celler (~ 50%), tubulin-innehållande celler (~ 10-15%) och O4-innehållande celler (~ 2-5%) 9 (DF). När odlas i en Neurobasal odlingsmedium kompletterat med B27 och glutamat, differentiera de in neuron-liknande celler som uttrycker β-III-tubulin (G) och MAP2 (H).
Discussion
De tekniker som presenteras här gör gnagare och mänskliga luktsinnet slemhinna en användbar modell för klinisk forskning kring orsakerna till nervsystemets utveckling och neurodegenerativa sjukdomar samt ett verktyg för att reparera patologiska eller traumatiserade hjärna. Protokollet är relativt enkelt och kan lätt utföras av en erfaren cellbiolog. Den relativa framgången av biopsin och kultur tekniker är höga.
Kritiska steg
- För insamling av gnagare lukt slemhinna, rekommenderas att inte överskrida en tidsgräns på 10 minuter mellan dödshjälp och den slutliga excision av luktsinnet vävnad.
- Den dissociation av gnagare luktsinnet lamina propria uppnås vanligtvis efter 10 min. inkubation i kollagenas IA. Om inte rekommenderar vi att samla in dagen efter supernatanten som odissocierad bitar av lamina propria flyta, centrifugera den på 200 g och mekaniskt skilja flytande lamina med hjälp av en pasteurpipett innan nicasiling cellerna i en ny brunn. Den första brunnen innehåller redan ansluten celler är fylld med färska odlingsmedium.
- För det mänskliga lamina propria, vilket är mer kompakt än gnagare vävnaden, rekommenderar vi inte en enzymatisk dissociation. Vävnaden är skivad och varje Explantation sätts in mellan botten av plast skålen och ett glas täckglas. Framgångsrika kulturer inkluderar explants vars tjocklek på mellan 200 till 500 ìm.
Möjliga ändringar
- Den nuvarande protokollet kan ändras något för att generera lukt nervceller in vitro. För detta ändamål är det neuro-epitel inte bort och hela luktsinnet slemhinnan är skivad med en McIlwain chopper (200 ìm tjocklek). Varje Explantation är klädd i en skål, delvis torkat i en timme och sedan med vätska i FCS-innehållande odlingsmedium. Under de första dagarna efter plätering, epitelceller och mesenkymala celler växer ut från Explantation. Då kommer neuron stamfäder migrera på toppen av detta cellager och differentierar till neuron.
- Rening av lukt stamceller kan uppnås med hjälp av flödescytometri. Specifik yta markörer kan hämtas från den förteckning som offentliggjorts i karakterisering papper 11.
- För transplantation experiment är det möjligt att använda en stam av råttor, vars lukt stamceller GFP-positiva. Denna råtta stam (Sprague Dawley, EGFP drivs av PGK promotor) finns på ITERT (Nantes, Frankrike). För att sätta in GFP-genen i människans lukt stamceller använder vi en metod baserad på lentivirus infektion.
- Detta dokument är inriktat på lukt Ecto-mesenkymala stamceller. Däremot kan en annan celltyp av ränta, lukt ensheathing celler renas från samma vävnad. Vi beskrev en metod för insamling och rening 1,17 och vi brukade mänskliga näsan ensheathing celler för en fas I / IIa klinisk studie med förlamade patienter 18.
- Som en medlem av mesenkymala stamceller superfamiljen, OE-MSC kan, under lämpliga odlingsbetingelser, differentieras till adipocyter, osteocytes och myocyter 11.
Framtida tillämpningar
- Vi har redan använt mänskliga luktsinnet biopsier för att studera cellulära och molekylära avvikelser hos patienter med autism, bipolär sjukdom, familjär dysautonomia, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och schizofreni 2-7. Teoretiskt sett kan alla sjukdomar i hjärnan kan studeras med hjälp av nasal biopsier eller perifera lukt stamceller.
- Gnagare och mänskliga näsan luktsinnet stamceller har redan inympade i djurmodeller av amnesi, Parkinsons sjukdom, cochlea skador och ryggmärgen trauma 12-16. Det är tänkbart att transplantera dessa celler i djurmodeller av Alzheimers sjukdom, ischemi i hjärnan, multipel skleros.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds ekonomiskt av ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les myopatier), Europeiska regionala utvecklingsfonden i PACA och Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Vi tackar tacksamt Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) för hennes effektiv hjälp under tiden förfaller inspelning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection of olfactory mucosa in rats | |||
| DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 | |
| Sodium Pentobarbital | |||
| Rongeur | Fine Science Tools | ||
| 26 gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN-2613R | |
| Forceps | |||
| Collection of olfactory mucosa in humans | |||
| Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Lidocaine | |||
| Epinephrine | |||
| Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Isolation of olfactory stem cells | |||
| Dispase II | Roche Group | 10 295 825 001 | |
| Dissecting microscope | |||
| Micro spatula | Fine Science Tools | ||
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 | |
| Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 | |
| Sphere formation and neuronal differentiation | |||
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030024 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich |
References
- Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).
- Ronnett, G. V. Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome. Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).
- Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia. Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).
- Matigian, N. Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders. Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).
- Arnold, S. E. Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease. Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).
- Boone, N. Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia. PLoS One. , (2010).
- McCurdy, R. D. Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses. Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).
- Roisen, F. J. Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890, 11-22 (2001).
- Murrell, W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).
- Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa. Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).
- Delorme, B. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).
- Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss. Stem Cells. , (2011).
- Murrell, W. Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease. Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).
- Nivet, E. Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Mackay-Sim, A. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial. Brain. 131, 2376-2386 (2008).
