Summary
Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.
Abstract
Olfaktör mukoza, burun boşluğunda bulunan tespit kokuları sorumlu. Aynı zamanda dış ortama maruz kalan ve yaşayan her bireyin kolayca erişilebilir sadece sinir doku. Sonuç olarak, bu doku patolojik beyin moleküler anomalileri tespit veya hücre tedavisi için yetişkin kök hücrelerin izole amaçlayan herkes için eşsizdir.
Beyin hastalıklarının moleküler anormallikler genellikle post-mortem toplanan sinir doku örnekleri kullanılarak çalışıldı. Ancak, bu malzeme, çeşitli sınırlamalar vardır. Buna karşılık, koku mukoza, kolay erişilebilir ve güvenli bir şekilde, koku alma 1 duyusunun kaybı olmadan biyopsi olabilir. Buna göre, koku mukozasının bir gelişimsel çalışmada hangi yetişkin insan (örneğin, otizm, şizofreni) 2-4 veya nörodejeneratif (örneğin Parkinson, Alzheimer) 4,5 hastalıkların bir "açık pencere" sağlar. Karşılaştırmalı moleküler çalışmalar nöron 3,7 4,6 ya da in vitro deneylerde ya Olfaktör mukoza için kullanılabilir .
Olfaktör epitel de bir sinir doku viral enfeksiyonlar bakteri, kirlilikten zarar görmüş olduğunu, yerini her geçen gün yeni nöron üretir. Bu kalıcı nöron atalarıdır sürekli değil, aynı zamanda, yani mukoza, neuroepithelium ve altta yatan lamina propria 8-10 iki bölmeleri içinde ikamet eden kök hücre . Yakın zamanda lamina propria bulunan yetişkin kök hücreleri arındırmak için bir yöntem geliştirdi ve kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BM-MSC) yakından ilişkili olduğunu göstermiştir ettikten sonra, biz (onlara koku alma ekto mezenkimal kök hücreleri adında OE- MSC) 11.
İlginçtir ki, BM-MKH karşılaştırıldığında, OE-MKH yüksek proliferasyon oranı yükseltilmiş clonogenicity ve sinir hücrelerine ayırt etmek için bir eğim gösterilecek. Biz, şizofreni ve Parkinson hastalığı 4 yeni aday genler açıklayacak adanmış çalışmalar yapmak, bu özellikleri avantaj sağladı. Biz ve diğerleri de omurilik travma 12,13, koklear hasar 14 OE-MKH sonra ya da Parkinson hastalığı 15 veya 16 amnezi bir hayvan modellerinde, hücre tedavisi için aday umut verici olduğunu göstermiştir .
Bu çalışmada, sıçanlarda ve insanlarda koku alma mukoza biyopsi yöntemleri mevcut. Toplandıktan sonra, lamina propria enzimatik bir enzimatik veya enzimatik olmayan bir yöntem kullanarak saflaştırılmış epitel ve kök hücreleri ayrılır. Koku alma kök hücreler Saf sonra ya çok sayıda büyümüş ve sıvı azot banked veya küreler oluşturacak şekilde uyarılmış veya sinir hücrelerine ayırt edilebilir. Bu kök hücreler karşılaştırmalı omics (proteomik, genomik transcriptomic epigenomic) çalışmaları için de kullanılabilir.
Protocol
1. Sıçanlar Koku Mukoza Koleksiyonu
- Temiz bir kültür kaput DMEM / HAM F12 kültür ortamı ile dolu üç adet 35 mm Petri kapları hazırlayarak başlayın.
- Herhangi bir ötenazi yöntemi kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından önceden onaylanmış ve kalifiye personel tarafından yürütülen olmalıdır. Sıçan gibi ketamin / xylazine anestezi sodyum pentobarbital veya diğer enjektabl formları ile derin anestezi girdikten sonra, başını kesmek ve cilt çıkarın. Uçucu anestezikler kaçınılmalıdır. Anestezi yeterliliği dekapitasyon önce ayak tutam tarafından değerlendirilecektir. Makas ile alt çene çıkarın ve bir rongeur yardımı ile, her iki tarafta da yüz kasları yok.
- Dişlerin arkasından başlayarak, bir rongeur nazal kavite, bir defada bir tarafı kaplayan kemik çıkarın. Turuncu / kahverengi organları burun arkasında bulunan koku alma konkalar görüş haline gelir.
- İncelikli bir forseps ile konkalar atın. Dik plaka, kribriform plaka ve burun boşluğunun tavan ark: 26 iğne kullanarak, üç satır boyunca doku keserek septum yatarken koku mukozası izole.
- Her iki tarafta biyopsileri toplayın ve bir DMEM / HAM F12 dolu Petri kabı aktarabilirsiniz. Bu prosedür, başlangıcından ötenazi itibaren 10 dakikadan daha uzun sürmemelidir.
- Şimdi, mukus ortadan kaldırmak amacıyla, orta dolu Petri kutularına biyopsileri iki kez transfer.
2. İnsanlar Koku Mukoza Koleksiyonu
- Bu prosedür, ilgili yerel etik kurul (lar) uygun bir Kulak Burun Boğaz (KBB) cerrah tarafından gerçekleştirilen olmalı, ve her ayaktan bilgilendirilmiş onam formu imzalamanız gerekir.
- 0 ° veya 30 ° rijit endoskop (4 mm çapında) kullanarak, her iki burun boşlukları varsayılan polip ya da herhangi bir inflamatuar lezyon varlığı incelemek ve değerlendirmek. Septum sapma dikkate alarak, en iyi nazal kavite seçin.
- Bir pamuk aplikatör kullanarak, 10 dakika boyunca, adrenalin, lidokain gibi lokal anestezi uygulanır.
- Throughcut etmoid forseps ile orta konka medial kök veya dorsomedial alanda septum ya bir iki milimetre kare biyopsi toplamak.
- Olfaktör biyopsi sonra 1 ml DMEM / HAM F12 ile dolu 2 ml steril bir tüp içine, steril bir iğne kullanılarak aktarılır. Ters tüp İpucu biyopsi kültür ortamında dalmış olduğundan emin olun.
- Buzdolabında bir kap içinde tüp takın ve araştırma laboratuvarı taşıma. Bu aşamada, biyopsi karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için özel beyin hastalıkları odaklanmış veya kök hücre üretmek için işlenen tek başına kullanılabilir.
3. İnsan ve Rat Mukoza Koku Kök Hücre İzolasyonu
- DMEM / HAM F12 biyopsileri yıkayın. 37 1 saat için 1 ml dispase II çözeltisi (2.4 IU / ml) ile dolu bir Petri kabındaki biyopsileri inkübe ° C
- Sonra, bir Kırınan ters ışık ile bir diseksiyon mikroskobu altında, mikro spatula kullanarak temel lamina propria olfaktör epitel kaldırılır.
- Olfaktör epitel çizgili olan lamina propria ile karşılaştırıldığında daha ince ve siyah arka plan üzerine yarı saydam görünen turuncu / kahverengi. Beyaz bir arka plan üzerinde, epitel ve lamina propria, kahverengi, gri görünüyor.
- Saflaştırılmış sonra, lamina propria DMEM / HAM F12 ile dolu bir Petri kabı içine aktarın.
- Doku kemirgen ise, lamina propria, iki adet 25 gauge iğne ile küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, 1 ml kollajenaz IA ile dolu bir 15 ml tüp parçaları aktarın.
- Tüp içinde, steril bir plastik pipet kullanarak, doku ayrıştırmaları. Sonra az 10 dakika, 37 tüp inkübe ° C
- Ayrışma sonlandırmak için tüp hafifçe rock ve 9, Ca-özgür ve Mg-free PBS ml ve 5 dakika boyunca 200 g santrifüj ekleyin.
- Plastik kültür kaplarına% 10 fetal sığır serumu, antibiyotik ve plaka ile desteklenmiş DMEM / HAM F12 kültür ortamı içinde hücre pelletini tekrar.
- Şimdi, doku, insan ise, sonra 200 ila 500 mikron arasında değişen, kalınlığı 3 ila 4 adet lamina propria dilim.
- Kendi 2 cm çapında kültür çanak içine her şerit yerleştirin ve steril 1.3 cm çapında cam kapak fişleri ile doku kapağı.
- Sonra, her kültürün çanak kültür ortamı ul 500 (% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik ile desteklenmiş DMEM / HAM F12) ekleyin.
- Ya da doku tipi için, her 2 ila 3 gün kültür ortamı yenilemek.
- Beş ila yedi gün sonra, kök hücre kültürü çanak işgal etmeye başlayacak ve iki hafta sonra konfluent olmalıdır. , Geçiş ulaştı ve kültür şişeler hücrelere transfer olduğunda confluency.
4. Küre Oluşumu ve Nöronal differeKoku Kök Hücreler, ntiation
- Kök hücre küre oluşturmak için, 37 şişeler az iki saat inkübe ° C poli-L-lisin. (METİN: 5 g/cm2).
- Tedavi şişeler santimetre kare başına 16.000 hücre yoğunluğu hücreleri Plaka.
- Her iki günde tamamlanan orta santimetrekare başına 0.2ml (DMEM / HAM F12, insülin, transferrin, selenyum (ITS-X,% 1), EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (takviye ile hücreleri beslemek, 50 ng / ml)).
- Iki ila beş gün sonra, kayan hücre küre ve ya yeniden plakalı toplamak veya hücre tedavisi hayvan modelleri aşılama önce onları ayrıştırmaları.
- Nöron-benzeri hücreler içine koku alma kök hücrelerin ayırt etmek için, B-27, penisilin, streptomisin, glutamin ve glutamat içeren Neurobasal ortamda 21 gün için onları yetiştirmek.
- Daha sonra her 3 günde bir orta değişiklikler yapmak. Nöron benzeri hücreler 2-3 hafta sonra görünmelidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Burun insan eksplant outgrowing kök hücreler (Şekil 2A) hızlı bölünen ve confluency 1-2 hafta içinde ulaşılabilir. Stemness, bir anahtar özelliği, nestin ifade değerlendirildi (Şekil 2B). EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (50 ng / ml) ile desteklenmiş bir serum serbest kültür ortamı ile poli-L-lizin büyüdüğü zaman, koku kök hücreler küre (Şekil 2C) neden olmaktadır. Serum içeren kültür ortamında yetişen yeni kaplama küre GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (Rakamlar ortaya çıkmasına neden 2D-F). Ancak, küre-kökenli hücreler kaderi değiştirilebilir. Örneğin, B27 ve glutamat, β-III tubulin (Şekil 2G) ve map2 (Şekil 2H) ifade nöron-benzeri hücreler içine burun koku kök hücrelerin çoğu ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında büyüdü.
Şekil 1, deney Genel şeması . Olfaktör mukoza biyopsileri, sıçan ve insan nazal kavite eksize. Eksplantlarındaki beyin hastalıkları biyobelirteçleri belirlenmesine yönelik karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için başlı başına kullanılabilir. Lamina propria ve nöro-epitel arasındaki etkileşimler, koku alma kök hücreleri izole etmek için, 45 dakika sonra, bir mikro-spatula ile epitel kaldırılır dispase II enzim bozulur ve. Kemirgen koku alma kök hücreler daha kollajenaz IA ile lamina propria dissociating tarafından seçilir. Outgrowing kök hücrelerin bütün istila kadar insan doku, koku alma lamina propria adet cam lamel altında kültüre. Çoğalması sonra, uygun bir kültür ortamı kullanılarak, koku kök hücreler küre üretebilir veya nöron hücrelerine ayırt. Olfaktör kök hücreler için kullanılabilir) onarım beyin hastalıkları ya da travma veya ii) merkezi sinir sistemi hastalıkları moleküler belirteçleri tespit. Çizimler Servier Tıp Sanat yardımı ile yapılır.
Şekil 2, burun, insan koku alma kök hücreleri Kültür ve farklılaşma . Serum içeren ortamda yetiştirilen lamina propria eksplant (A) büyüyen insan kök hücreleri, hızla bölünerek. Kök hücreler, stemness işaretleyici nestin (B) ifade eder. Poli-L-lisin kaplı plastik kaplama ve EGF ve FGF2 ile desteklenen bir serum serbest kültür ortamında yetiştirilen, koku kök hücreler küre (C) oluşturur. Küre kökenli hücrelerin, serum içeren kültür ortamında kaplama, doğuran GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (DF). B27 ve glutamat ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında yetişen, β-III tubulin (G) ve map2 (H) ifade nöron-benzeri hücrelere farklılaşırlar.
Discussion
Burada sunulan teknikleri nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların yanı sıra, patolojik ya da travmatize beyin tamiri için bir araç nedenleri içine kemirgen ve insan olfaktör mukoza klinik araştırmalar için yararlı bir model. Protokol nispeten basittir ve deneyimli bir hücre biyoloğu tarafından kolayca yapılabilir. Biyopsi ve kültür teknikleri için başarı oranı yüksektir.
Kritik adımlar
- Kemirgen olfaktör mukoza toplanması için, ötanazi ve son koku doku eksizyonu arasında 10 dakikalık bir zaman sınırı geçmemek üzere tavsiye edilir.
- Kemirgen koku alma lamina propria ayrılma genellikle 10 dakika sonra elde edilir. kollajenaz IA kuluçka. Değilse, lamina propria float undissociated bit, 200 g santrifüj ve mekanik bir zamanda yeni hücreler replating önce Pasteur pipeti kullanarak kayan lamina ayrıştırmaları süpernatantı gün sonra toplamak için önerilir. Zaten bağlı hücreleri içeren ilk sıra taze kültür ortamı ile doludur.
- Kemirgen doku daha küçük olan insan lamina propria, için, biz bir enzimatik ayrılma önermiyoruz. Doku dilimlenmiş ve her eksplant, plastik tabak alt ve cam lamel arasına yerleştirilir. Başarılı kültürler, kalınlık aralığı 200 ila 500 mikron eksplantlar içerir.
Olası değişiklikler
- Geçerli protokol in vitro olfaktör nöronların üretmek için biraz değiştirilmiş olabilir. Bu amaçla, nöro-epitel kaldırılmaz ve tüm koku mukozası bir McIlwain kıyıcı (200 mikron kalınlığında) ile dilimlenmiş. Her eksplant, bir tabak içinde kaplama, kısmen bir saat süreyle kurutulur ve sonra FCS içeren kültür ortamı ile sulandırılır. Ilk gün kaplama sırasında, epitelyal ve mezenkimal hücreler eksplant büyür. Daha sonra, bu hücre tabakasının üstüne nöron atalarıdır göç ve nöronlar farklılaşırlar.
- Koku alma kök hücrelerin Arıtma flow sitometri kullanılarak elde edilebilir. Özgül yüzey belirteçleri kağıdı 11 karakterizasyonu yayınlanan listeye alınabilir.
- Nakli deneyleri için, koku alma kök hücre GFP pozitif sıçanlarda bir yük kullanmak mümkündür. Bu sıçan suşu (Sprague Dawley, eGFP PGK organizatörü tarafından yönlendirilen) ITERT (Nantes, Fransa) mevcuttur. Koku alma, insan kök hücreleri, GFP geninin eklemek için, biz lentivirüs enfeksiyon dayalı bir yöntem kullanabilirsiniz.
- Bu yazıda, koku alma ekto mezenkimal kök hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Ancak, faiz, koku alma ensheathing hücreleri, başka bir hücre tipi, aynı doku arındırılmalıdır. Biz onların toplama ve arıtma 1,17 için bir yöntem tanımlanmış ve paraplejik hastaların 18 faz I / IIa klinik çalışma için insan burun ensheathing hücreleri kullandı.
- Mezenkimal kök hücre süper ailesinin bir üyesi olarak, OE-MKH adipositler, osteosit ve miyositler 11 ayırt etmek için, uygun kültür koşulları altında edebiliyoruz.
Gelecekteki uygulamalar
- Biz zaten, otizm, bipolar bozukluk, ailesel disotonomi, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve şizofreni 2-7 hastalarda hücresel ve moleküler anomaliler çalışma insan koku alma biyopsi kullanmışlardır . Teorik olarak, tüm beyin hastalıkları, burun biyopsileri ya da periferik koku alma kök hücreler kullanılarak incelenebilir.
- Kemirgen ve insan burun koku alma kök hücreler zaten amnezi, Parkinson hastalığı, koklear hasar ve omurilik travması 12-16 hayvan modellerinde aşılı olmuştur. Alzheimer hastalığı, beyin iskemi, Multipl skleroz hayvan modellerinde bu hücrelerin nakli için akla.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, mali ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Miyopatiler), PACA ve Irme Feder (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale) tarafından desteklenmiştir. Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Enstitüsü) minnetle zaman atlamalı kayıt sırasında onu etkin yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection of olfactory mucosa in rats | |||
| DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 | |
| Sodium Pentobarbital | |||
| Rongeur | Fine Science Tools | ||
| 26 gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN-2613R | |
| Forceps | |||
| Collection of olfactory mucosa in humans | |||
| Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Lidocaine | |||
| Epinephrine | |||
| Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Isolation of olfactory stem cells | |||
| Dispase II | Roche Group | 10 295 825 001 | |
| Dissecting microscope | |||
| Micro spatula | Fine Science Tools | ||
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 | |
| Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 | |
| Sphere formation and neuronal differentiation | |||
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030024 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich |
References
- Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).
- Ronnett, G. V. Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome. Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).
- Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia. Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).
- Matigian, N. Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders. Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).
- Arnold, S. E. Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease. Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).
- Boone, N. Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia. PLoS One. , (2010).
- McCurdy, R. D. Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses. Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).
- Roisen, F. J. Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890, 11-22 (2001).
- Murrell, W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).
- Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa. Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).
- Delorme, B. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).
- Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss. Stem Cells. , (2011).
- Murrell, W. Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease. Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).
- Nivet, E. Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Mackay-Sim, A. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial. Brain. 131, 2376-2386 (2008).
