Summary
Trichuris muris infección intestinal es un modelo de la inmunidad Th2 en ratones resistentes al generar una respuesta Th2 protección y ratones susceptibles de generar una respuesta Th1 patológicos.
Abstract
Trichuris muris es un patógeno natural de los ratones y es biológicamente y antigénicamente similares a las especies de Trichuris que infectan a los seres humanos y animales 1. Los huevos infectantes se dan mediante una sonda nasogástrica, eclosionan en el intestino delgado distal, invaden las células epiteliales intestinales (IEC) que la línea de las criptas del ciego y el colon proximal y en la maduración de los huevos de los gusanos liberación en el medio ambiente 1. Este modelo es una herramienta poderosa para examinar los factores que las células CD4 + de control T helper (Th) activación de las células, así como cambios en el epitelio intestinal. La respuesta inmune que se produce en las cepas endogámicas, como C57BL / 6 y BALB / c, se caracteriza por las citocinas Th2 polarizadas (IL-4, IL-5 e IL-13) y la expulsión de los gusanos, mientras que Th1 asociada a las citocinas (IL -12, IL-18, IFN-γ) promover las infecciones crónicas en AKR genéticamente susceptibles / J ratones 2-6. Citocinas Th2 promover cambios fisiológicos en el microambiente intestinal incluyendo la rápida rotación de la IEC, la diferenciación de las células caliciformes, la contratación y cambios en la permeabilidad del epitelio y la contracción del músculo liso, que se han implicado en la expulsión del gusano 7.15. Aquí detallamos un protocolo para la propagación de los huevos de Trichuris muris que puede ser utilizado en experimentos posteriores. También proporcionamos una pesca experimental de la muestra con sugerencias para el análisis post-infección. En términos generales, este protocolo se proporcionará a los investigadores con las herramientas básicas para realizar una Trichuris muris ratón modelo de infección que puede ser utilizado para tratar las cuestiones relacionadas con proclividad Th en el tracto gastrointestinal, así como funciones efectoras inmunes de la IEC.
Protocol
1. Propagación de los huevos de Trichuris muris
- Para generar nuevos lotes de huevos de Trichuris muris, 20-30 infectar ratones inmunodeficientes (por ejemplo, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) o 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) o ratones genéticamente susceptibles ( por ejemplo. AKR / J), que es de 6-8 semanas de edad con aproximadamente 300 huevos de Trichuris muris mediante una sonda nasogástrica.
- Después de 32-35 días el sacrificio de los ratones por asfixia de CO 2.
- Exponer el lado ventral del ratón y húmedo en el abdomen con un 70% de etanol.
- Pinzas de agarre utilizando la piel del abdomen y hacer una pequeña incisión con unas tijeras. Cortar la piel para exponer el contenido abdominal.
- Identificar el ciego y el intestino grueso proximal, y eliminarlos.
- Coloque el ciego y el intestino grueso proximal en una placa de Petri de 10 cm que contiene Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con 500 U / ml de penicilina y 500 mg / ml de estreptomicina (P / S). Cortar el ciego abierta para exponer la luz y los gusanos. Utilizando unas pinzas ciego colocarlos en un vaso de tampón fosfato salino (PBS) y agite suavemente para eliminar las heces.
- Volver al ciego placa de Petri y el uso de pinzas curvas suaves (Roboz RS-5047) tire suavemente de gusanos y colocarlos en un pozo de una placa de 6 pocillos que contienen 5 ml de DMEM + P / S.
- Repita este proceso para todos los ratones.
- Colocar 6 pocillos en un recipiente Tupperware con una toalla de papel húmeda para mantener la humedad y se incuba a 37 ° C durante 4 horas.
- Después de 4 horas eliminar los gusanos utilizando pinzas curvas suaves y los dividieron en dos nuevos pozos de la placa de 6 pocillos que contienen 5 ml de DMEM + P / S. Cosecha el contenido del pozo original y colocarla en un tubo Falcon de 15 ml. Girar el tubo a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante de reserva como el antígeno de 4 horas (se puede utilizar para re-estimulación de células después de la PBS de diálisis, donde los rendimientos son típicas de proteínas 10-20 mg por cada 20 ratones) y resuspender que contengan huevo sedimento en el agua del grifo en autoclave.
- Coloque la placa de 6 y de nuevo a 37 ° C durante la noche. Remoción y eliminación de los gusanos. Cosecha de los contenidos de los pozos en un tubo Falcon y giran a 3000 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y la reserva como antígeno durante la noche (se puede utilizar para Trichuris Ag. ELISA específico isotipo de anticuerpos después de la PBS de diálisis, donde los rendimientos son típicas de proteínas 10-20 mg por cada 20 ratones) y que contiene huevo volver a suspender el pellet en el agua del grifo en autoclave.
- Combine 4 horas y los huevos durante la noche y el filtro de los huevos a través del tamiz 70μm para eliminar los gusanos de sobra a continuación, transferir a un matraz de 75 cm 2. Mantenga matraz en un sitio oscuro cubierto de lámina por 6 semanas a temperatura ambiente, (RT).
- Lavar los huevos en el agua del grifo en autoclave y volver a suspender a 50 huevos viables en 50 microlitros. Para ello, los huevos centrífuga a 3000 rpm durante 5 min y se resuspenden en 50 ml de agua de la llave ~ estéril. Retire 50 huevos l y el lugar en un portaobjetos de vidrio. Usando el aumento de 40x contar el número de huevos embrionados viables en el l 50. Diluir los huevos para dar 50 huevos viables en 50 microlitros. Para las imágenes de huevos viables por favor vea el estudio de Kopper y Mansfield 16.
2. La infección aguda de los ratones experimentales con Trichuris muris huevos (200 huevos / ratón)
- Huevos bien volver a suspender y eliminar un volumen suficiente para tratar el número de ratones X 2 (por ejemplo, de 10 ratones tener 200 x l 10 ratones x 2 = 4 ml de huevos) y colocarlos en un tubo de tapa de 14 ml fácil.
- Invierta el tubo de 14 ml snap tapa para mezclar. Lleva hasta 200 l de huevos en jeringa de 1 ml en una aguja de tamaño de la alimentación adecuada (para los ratones un peso de 25 gramos que utiliza calibre 18 1 1 / 2 "agujas). En pescuezo por un lado, el ratón y con la otra mano administrar los huevos mediante una sonda nasogástrica .
- Esperar 21 días.
3. De pesca experimental
- El día 21 el sacrificio de los ratones con CO 2.
- Recoger la sangre de los ratones mediante punción cardíaca, en una jeringa no heparinizada, y se almacenan a 4 ° C. Al día siguiente aislar el suero y congelar a -20 ° C. Suero puede ser utilizado para la detección de IgG específica Trichuris e IgE por ELISA.
- Exponer el lado ventral del ratón y húmedo en el abdomen con un 70% de etanol.
- Pinzas de agarre utilizando la piel del abdomen y hacer una pequeña incisión con unas tijeras. Cortar la piel y la membrana subyacente para exponer el contenido abdominal.
- Identificar el intestino delgado, el ciego y el colon. Coge el ciego con unas pinzas y extraer de la cavidad abdominal. Con otro par de pinzas de empujar el intestino delgado hacia la derecha exponer los nódulos linfáticos mesentéricos (mLNs). Retire la mLNs teniendo cuidado de no cortar los intestinos y el lugar en un falcon de 15 ml que contiene 2 ml de los medios de comunicación. Si lo desea estos pueden ser procesados y volvieron a estimular in vitro (4x10 6 / ml en 1 ml en placas de 24 pocillos con 1 mg / ml αCD3/CD28 o con 50μg/ml 4h Trichuris Ag) durante 72 horas para el análisis de citoquinas por ELISA y f intracelularcitometría de baja.
- Cortar el ciego y el colon.
- Con unas pinzas, expulsar partículas fecales de colon distal y el lugar en un tubo de 2 ml Axygen. Congelar a -20 ° C. Bolitas fecales pueden ser analizados por Western blot para la expresión de la resistina, como la molécula de β (β-RELM).
- Retire la punta del ciego (~ 0,5 cm). Para eliminar las heces mantener la punta del ciego con unas pinzas y enjuague con PBS utilizando una jeringa de 3 ml y aguja de calibre 22 en una placa de Petri. Lugar en paraformaldehído al 4% fresco en un tubo de 5 ml tapa Falcon fácil. Almacenar a 4 ° C. Estos pueden ser incluidos en parafina, se cortaron y montaron en portaobjetos para su análisis histológico.
- Extraer un pedazo de colon proximal (aproximadamente 1 cm) para el ARN. Ponga la muestra en 2 ml tubo Axygen con 500 l RNAlater. Almacenar a 4 ° C. Estas muestras pueden ser analizadas para la expresión del ARNm de qPCR.
- Coloque el resto del ciego en una placa de Petri etiquetados y se congelan a -20 ° C.
4. La enumeración de los gusanos Trichuris muris en el ciego
- Quitar el ciego del congelador y colóquela en un plato de Petri que contiene ~ 5 ml de agua.
- El uso de tijeras, corte ciego para exponer la luz.
- Mantenga el ciego con unas pinzas y agite vigorosamente el ciego para eliminar la mayoría de las heces.
- Transferencia a otro ciego placa de Petri que contiene el agua y el uso de pinzas curvas suaves raspe suavemente la IEC el tejido subyacente.
- Transferencia de ciego a una nueva placa de Petri que contiene agua y raspar el tejido restante vigorosamente con fórceps, extracción del tejido en trozos pequeños.
- Utilizar un microscopio de disección para contar todos los gusanos en los 3 de los platos de Petri. Como encontrar un gusano de sacarlo de la placa para asegurarse de que el gusano lo mismo no se cuenta dos veces. Si los gusanos son dañados (es decir, roto por la mitad) sólo cuentan los extremos gruesos o finos para obtener una cifra exacta.
5. Resultados representante
El modelo de Trichuris muris infección permite a los investigadores para cuantificar la carga parasitaria y la respuesta inmune sistémica, así como para examinar histológicamente la respuesta inflamatoria en el intestino ciego distal. Cuando la luz del ciego cosechado se expone, gusanos Trichuris se pueden enumerar usando un microscopio de disección (Figura 1-B). Parámetros de inmunidad a Trichuris también incluyen isotipo de anticuerpos IgG1 cambiar a (asociado con la inmunidad de tipo Th2) en los animales resistentes, y IgG2a (asociados con la inmunidad de tipo Th1) en animales susceptibles (fig. 1C). Expresión de la copa de células específicas de la proteína resistin-como la molécula de β (β-RELM) se asocia con un aclaramiento de Trichuris y es detectable por análisis de Western blot (Figura 2). La porción distal del intestino ciego se puede teñir con ácido periódico de Schiff (PAS) para evaluar las respuestas de las células caliciformes y el grado de inflamación intestinal en respuesta a la infección (Figura 3).
Figura 1. La cuantificación de la inmunidad de Trichuris muris. (A) Resistente (B6) expulsar a los ratones Trichuris muris a los 21 días post-infección. Por el contrario, susceptibles (AKR / J) de ratones con infección crónica por Trichuris, lo que resulta en el establecimiento de los parásitos. Cada barra representa la media ± SEM de 4-8 animales por grupo. (B) Los gusanos se cuentan utilizando un microscopio de disección. El panel superior muestra los gusanos en el aislamiento, el panel inferior muestra los gusanos en la presencia de la IEC y las heces. (C) Trichuris específicos de los títulos de IgG2a se determinó por ELISA de suero diluido (1:2 dilución, a partir de las 1:20 de dilución y terminando a las 1:2560) en placas recubiertas con antígeno excretor Trichuris (O / N Ag, 5 mg / ml). Susceptibles AKR / J ratones tienen niveles notablemente más altos de Trichuris IgG2a específicos en suero de ratones B6 resistente.
Figura 2. Liquidación de Trichuris muris se asocia con la expresión de la copa de células específicas de la proteína β-RELM 7. RELM-β de producción pueden ser detectados a partir de partículas fecales de Trichuris infectadas resistentes (B6), pero no susceptibles (AKR / J) en ratones mediante el análisis de Western blot. Cada carril es representante de un solo animal, (N) = ingenuo, (Tm) = 21 días Trichuris ratones infectados.
Figura 3. El examen histológico de la infección por Trichuris ciego siguientes distal. Secciones 7.5 micras de la parte distal ciego teñidos con PAS. Hiperplasia de células caliciformes y la producción de moco son evidentes en resistencia (B6), pero no susceptibles (AKR / J) ratones después de la infección por Trichuris.
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Discussion
Este protocolo detalla un estándar de alta dosis aguda de la infección por Trichuris muris que pueden ser modificados según sea necesario por el investigador. Por ejemplo, los ratones pueden ser sacrificados y tejidos recolectados en días diferentes. Para determinar que los ratones han establecido con éxito la carga del gusano completo que puede ser sacrificado en el día 14, momento en el que todos los ratones que llevan una carga de aproximadamente 200 gusanos. Los ratones también pueden ser infectados durante 32 días en cualquiera de los gusanos detectados han alcanzado la madurez y se mantendría con el anfitrión de la duración de su vida. Además, el protocolo se puede adaptar el modelo de infección crónica Trichuris muris. Para ello, la dosis administrada de huevo se puede ajustar a una infección de dosis baja (alrededor de 30 huevos). A esta dosis, por lo general los ratones resistentes no para inducir una respuesta Th2 de protección, sino más bien generar una respuesta Th1 y mantener una carga de aproximadamente 20 gusanos 17.
Una de las ventajas del modelo de infección por Trichuris muris en modelos de infección en otros es que, en general, los ratones infectados no presentan ninguna morbilidad o mortalidad. Sin embargo, hay factores que pueden afectar el resultado experimental de que los investigadores deben tener en cuenta. El primer factor es la tensión de fondo de los ratones. Como se indica en los resultados, los ratones C57BL / 6 son resistentes y AKR / J ratones son susceptibles, y, asimismo, otras cepas puras pueden tener una infección de diferentes perfiles. Por lo tanto, es importante que el investigador sea consciente de la tensión de fondo de su ratón y el uso de los ratones de control adecuadas. Además, no puede ser pulsaciones del ratón a la variación en la eliminación del parásito lo que no hay necesidad de preocuparse si algún control de ratones normalmente resistentes a tener hasta 30 gusanos a los 21 días post infección. Además, los ratones susceptibles, no siempre mantienen un total de 200 hilos carga parasitaria, pero puede variar de aproximadamente 75 a 200 gusanos por el ciego. Esta variación puede ser explicada por la variación natural en la flora intestinal de los ratones alojados en diferentes establecimientos.
Un factor que afecta negativamente a la infección por Trichuris muris es la presencia de lombrices intestinales. Los oxiuros infectan el mismo sitio anatómico que Trichuris e inducir una respuesta inmune que puede confundir la interpretación de los estudios de Trichuris. Además, las lombrices intestinales tratamiento (albendazol, fenbendazol) también mata Trichuris. En este procedimiento experimental, utilizamos ratones a los que se mantienen bajo condiciones de patógenos específicos libre, y es fundamental que los ratones experimentales se mantiene oxiuros libre, previo y durante la infección por Trichuris muris.
Algunos investigadores puntos de menor importancia debe tener en cuenta:
- Los huevos deben mantenerse en el agua, no PBS.
- Los huevos son muy pesados y por lo tanto, debe volver a suspenderse antes de la entrega a cada ratón. Además, la carga sólo un volumen suficiente de huevos para infectar a un ratón a la vez, ya que se instalará en la jeringa.
- Algunas cepas raras muestran las diferencias de sexo en la infectividad, pero en la mayoría de los casos, ya sea hombres o mujeres pueden ser utilizados para las infecciones de Trichuris muris.
- Ratones ingenuos pueden ser alojados en la misma jaula, como los ratones infectados ya que no hay preocupación de la transferencia horizontal de la infección con este modelo.
En general, la infección por Trichuris muris es un procedimiento fácil de realizar que los modelos de Th2-dependiente de la inmunidad y puede ser adaptado a las necesidades de los investigadores individuales.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de British Columbia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MSH-95368, 89773 y MOP-MOP-106623 a la República Checa) y la Fundación Canadiense para la Innovación. SCM es el destinatario de una Asociación de CIHR / canadiense de la comunión Gastroenterología postdoctoral. CZ es un investigador de Nueva CIHR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
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