Summary
Eine Methode des Gentransfers für die Behandlung von ischämischen Herzinsuffizienz wird anhand einer Schweinegrippe-Modell des Myokardinfarkts. Unsere einfache und reproduzierbare Methode ermöglicht es uns, leicht Beurteilung der Wirksamkeit verschiedener Gen-Transfers mit einer sehr einfachen und reproduzierbaren Art und Weise.
Abstract
Verschiedene neue Technologien werden für Patienten mit Herzinsuffizienz entwickelt. Gut etablierte präklinische Auswertungen notwendig sind, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu bestimmen.
Die Gentherapie mit viralen Vektoren ist einer der vielversprechendsten Ansätze für die Behandlung von Herzerkrankungen. Viral Lieferung von verschiedenen Genen, indem der Träger-Gen hat unermessliche therapeutisches Potenzial.
In diesem Video wird der vollständige Prozess von einem Tiermodell der Herzinsuffizienz Schöpfung durch Gentransfer folgten präsentiert mit einem Schweine-Modell. Zunächst wird Myokardinfarkt durch Verschluss der proximalen linken vorderen absteigenden Koronararterie angelegt. Herz Umbau Ergebnisse bei chronischer Herzinsuffizienz. Einzigartig an unserem Modell ist eine ziemlich große Narbe, die wirklich spiegelt Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz, die aggressive Therapie für positive Ergebnisse erfordern. Nach Myokardinfarkt Gründung und Entwicklung von Narbengewebe, ist eine intrakoronare Injektion des Virus bei gleichzeitiger Nitroglycerin Infusion unter Beweis gestellt. Unsere Injektion Methode bietet eine einfache und effiziente Gentransfer mit erhöhter Genexpression. Diese Kombination aus einem Myokardinfarkt Schweinegrippe-Modell mit intrakoronare Virus Lieferung hat sich eine konsistente und reproduzierbare Methodik, die nicht nur hilft, die Wirkung einzelner Gen-Test, sondern auch die Wirksamkeit von vielen Genen als therapeutische Kandidaten.
Protocol
1. Myokardinfarkt Schöpfung
- Weibliche Yorkshire Schweine (20kg) von Animal Biotech Industries (Doylestown, PA) sind bereits medizinische Verwendung Telazol (Tiletamin angewendet / Zolazepam) (8,0 mg / kg) und Buprenorphin (0,6 mg).
- Die Tiere werden intubiert und dann belüftet mit 100% Sauerstoff. Eine Vollnarkose ist mit Propofol (5-8mg/kg/hr) während des gesamten Verfahrens beibehalten.
- Die femorale Seite ist mit 70% igem Alkohol durch Povidoniod, hergestellt. Eine perkutane Punktion bietet Zugriff auf die Arterie und für Mantel-Platzierung. Nach Scheide Einführen wird 3000-5000 IE Heparin verabreicht IV zu einer aktivierten Gerinnungszeit von 250-300 Sekunden zu halten.
- Eine Bolusgabe von Amiodaron (75 mg) wird intramuskulär verabreicht. Die intravenöse Injektion einer 1000 ml Kochsalzlösung Tasche mit Amiodaron (75 mg), Atropin (2 mg) und Kaliumacetat (20 mEq) wird gestartet und gepflegt mit einer Geschwindigkeit von 150 ml / h während des gesamten Verfahrens.
- A 7 Fr Hockeyschläger-Katheter (Cordis, Miami, FL) fortgeschritten ist auf der linken Koronararterie und eine Koronarangiographie durchgeführt wird. Eine 0,014-Zoll-Führungsdraht (Abbott Park, IL) ist in der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) fortgeschritten. Ein 8-mm-lang, 4,0-mm-VOYAGER over-the-Wire-Ballon (Abbott Park, IL) ist fortgeschritten und am proximalen LAD positioniert und die koronare Ballon ist bis 3 atm aufgeblasen. Verschluss der LAD wird durch Angiographie bestätigt.
- Bei kontinuierlicher EKG-und hämodynamische Überwachung, ist der Verschluss für 90 Minuten gehalten. Bösartige ventrikulären Arrhythmien können gelegentlich innerhalb der ersten 40 Minuten auftreten, in diesem Fall sofortige Lieferung von Gleichstrom Schocks von 200 J und 300 J verabreicht werden. Normalerweise gibt es zwei Gipfel Zeitrahmen von Herzrhythmusstörungen, einer zwischen 2 und 10 Minuten und die andere zwischen 25 und 35 Minuten nach dem Aufblasen des Ballons. Diligent und sofortige Defibrillation sind der Schlüssel zur erfolgreichen Myokardinfarkt Schöpfung, da es mehr als 95% Inzidenz von Eingabe Kammerflimmern innerhalb der Zeitrahmen angegeben werden. Wenn die unverzügliche und angemessene Defibrillation durchgeführt wird, ist das Überleben sehr hoch. Wenn der Blutdruck sinkt unter 80 mmHg, ist Raumbelastung mit schnellen intravenösen Infusion von physiologischer Kochsalz erreicht.
- Der Ballon wird entleert und alle Geräte werden entfernt.
- Der Mantel aus der Femoralarterie entfernt wird, ist die Anästhesie vorenthalten, und das Tier während der Wiederherstellung überwacht. Die intravenöse Kochsalzlösung mit Amiodaron, Atropin und Kaliumacetat Infusion bei 50 ml / h reduziert und wird über Nacht gegeben. Eine intramuskuläre Injektionen von Nitroglycerline und Furoscemide verabreicht wird. Dann wird das Tier darf sich zu erholen und eine sorgfältige EKG-Überwachung ist für mindestens 3 Stunden fortgesetzt.
- Aspirin (200mg) PO wird für fünf Tage gegeben werden.
Häufigsten Komplikationen während und nach dem Myokardinfarkt Schöpfung Verfahren sind koronare Dissektion Einstichstelle Hämatome, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Eine Verfeinerung Technik und gründliche Überwachung erforderlich ist zur Verhütung und Bewältigung dieser Komplikationen.
2. Virus Injection
- Die Tiere werden wie oben angegeben in den Myokardinfarkt Schöpfung Schritte 1-3. Die gleiche Dosis von Heparin sollte erwogen werden, Thrombose während der Virus-Injektion zu verhindern.
- Ein 5Fr Hockeyschläger Katheter (Cordis, Miami, FL) ist auf der linken Koronararterie fortgeschritten. Nach der Angiographie, sind zwei von 0,014-Zoll-Führungsdrähte fortgeschritten, man in die LAD und einer in die linke Zirkumflex Koronararterie (LCX), um die Position des Katheters zu beheben.
- Arteriellen Blut (-20 ml) wird aus dem Katheter gezogen. Um zu verhindern, die Ischämie während der Infusion wird die Hälfte verdünntes Blut zur Herstellung verwendet. Das Virus wird mit 10 ml Blut vermischt und verdünnt auf 20 ml mit physiologischer Kochsalzlösung. Die restlichen 10 ml ist auch zu 20 ml verdünnt und liefern verbleibende Virus innerhalb der Katheterlumen.
- Die intravenöse Nitroglyzerin (20 ug / min) wird durch die Ohrvene gestartet.
- Die Katheterspitze wird am proximalen linken Haupttrakt platziert. Der Druck durch den Katheter wird überwacht, um sicherzustellen, dass der Katheter nicht eingeklemmt.
- Das Virus gemischtes Blut (15 ml) wird durch den Katheter über 15 Minuten mit einer Infusionspumpe in die linke Koronararterie injiziert. Nach 15 Minuten wird die Spritze mit dem Flush ausgetauscht und Infusion für 10 Minuten fortgesetzt.
- Ein Draht und ein Katheter sind rechte Koronararterie die gleiche Weise wie linken Koronararterie fixiert.
- Die restlichen 5 ml Blut mit dem Virus vermischt wird in der rechten Koronararterie für 5 Minuten mit 10 Minuten spülen, gefolgt injiziert.
3. Repräsentativer Fall
Abbildung 1 zeigt die linke Ventrikulographie bei 1 Monat nach dem Myokardinfarkt Schöpfung. Die Wand des linken Ventrikels Bewegung ist deutlich mit einer Ejektionsfraktion (EF) der Beeinträchtigung31%. Abbildung 2 zeigt die Querschnitte des linken Ventrikels nach 1 Monat. Eine große Narbe von der Basis bis zur Spitze des vorderen Wand zu sehen ist. Die durchschnittliche EF nach 1 Monat nach Herzinfarkt in diesem Modell ist 36% und die durchschnittliche enddiastolischen Volumen 83 ml, während der Durchschnitt der in der gleichen Größe Tier ohne einen Myokardinfarkt beträgt 68% und 42 ml. Abbildung 3 zeigt die Expression von beta-gal in der linksventrikulären Grenzzone Bereich 1 Monat nach der Injektion von Adeno-assoziierten Virus (2 x 10 12 DNAse resistent Partikel rAAV1 CMV Lac-Z). Eine verstärkte Expression wurde in das Virus injiziert Bereich gefunden.
Abbildung 1. Auswurffraktion von links Ventrikulographie gemessen 1 Monat nach Myokard-Infarkt Schöpfung. Linken Ventrikels ist auf 92,5 ml erweitert und Vorderwand Bewegung ist erheblich beeinträchtigt.
Abbildung 2. Die Querschnitte des linken Ventrikels nach 1 Monat nach Myokard-Infarkt Errichtung durch Triphenyltetrazoliumchlorid gefärbt, um abzugrenzen Bereich der Narbe. Eine große Narbe von der Basis bis zur Spitze des vorderen Wand zu sehen ist.
Abbildung 3. Beta-gal-Expression durch Adeno-assoziierte Virus (2 x 10 12 DNAse beständig Teilchen rAAV1 CMV Lac-Z) induziert. Eine verstärkte Expression ist in der Grenzzone zwischen dem Infarkt und dem normalen Gewebe, 1 Monat nach der intrakoronare Virus Injektion gefunden. Rechten unteren Bild zeigt die negative Kontrolle, bei denen nur physiologische Kochsalzlösung in die Herzkranzgefäße injiziert wurde mit dem gleichen Protokoll.
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Discussion
Unter den verschiedenen Ursachen der Herzinsuffizienz, Ischämie bei weitem die häufigste in der Ätiologie. Zur Überwindung dieser schweren Krankheit werden verschiedene therapeutische Ansätze entwickelt. Eine sorgfältige Evaluierung von Therapien erforderlich sind, bevor diese vielversprechenden Therapien können in den Kliniken angewandt werden. Daher ist die Einrichtung eines ischämischen Herzinsuffizienz-Modell, dass die klinischen Bedingungen der Patienten stellt entscheidend für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz-Therapien. Unsere Schweine Myokardinfarkt-Modell erfüllt diese Anforderungen translationale.
Zur Induktion Herzinsuffizienz durch die Schaffung eines Myokardinfarkts, muss der Infarkt-Bereich zu groß sein. Unser Modell hat einen größeren Narbe im Vergleich zu den früheren Studien, die auch verwendet werden, um eine endovaskuläre Myokardinfarkt Modell 1. Wir haben festgestellt, dass die Verabreichung von Amiodaron und Aufrechterhaltung des Blutdrucks über 80 mmHg während der koronaren Okklusion ist wichtig, sowohl die Überlebensrate und die Infarkt vergrößern. Während Isofluran ist ein wirksames Anästhetikum für dieses Verfahren 1-2, fanden wir, dass mit Propofol, höheren Blutdruck aufrecht erhalten werden kann. Darüber hinaus ist Isofluran berichtet, mehr Herz-schützende Wirkung im Vergleich zu Propofol 3 haben, und dies könnte zu einer verminderten Infarktgröße führen.
Cardiac Gentherapie ist heute einer der vielversprechendsten Ansätze zur Herzinsuffizienz, und es gibt verschiedene Strategien, um das Gen zu übertragen. Vor allem intrakoronare Injektion von viralen Vektoren, die ein Gen, ist eine einfache und weniger invasive Technik. Verschiedene Versuche sind gemacht, um die Genexpression zu erhöhen. Unser Labor hat festgestellt, dass die Infusion Nitroglycerin bei der Virus-Injektion erhöht die Genexpression (I. Karakikes, unveröffentlicht).
Gentransfer von SERCA2a mit Adeno-assoziierte virale Vektoren in positive Ergebnisse beim Menschen 4 geführt haben. Weitere Verbesserungen der kardialen Gentherapie sind mit zusätzlichen Träger Gene sowie Vektor-Verfeinerungen zu erwarten. Unser Lieferprogramm Methode bietet einen einfachen und effizienten Gentransfer mit erhöhter Genexpression und kann leicht übersetzt werden in die Klinik.
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Disclosures
Alle Autoren haben keinerlei kommerzielle Vereinigungen, die als Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dem Manuskript darstellen könnte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Leducq Foundation durch die Caerus Netzwerk (RJH) unterstützt, die von NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 und P20HL100396 (RJH). DL wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir möchten Lauren Leonardson für ihre technische Unterstützung in diesem Projekt danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
