Summary
描述的是一种廉价的，同时检测到43个分子靶点的高通量方法。 MPCR / RLB的应用，包括微生物打字和多种病原体从临床标本的检测。
Abstract
多重PCR /反向线杂交实验可以检测高达43在43个样品使用一个多重PCR反应探头上的尼龙膜，这是可重复使用的杂交分子靶点。探头5'胺修改，以允许固定膜。引物5'端生物素修改，允许使用的杂交，PCR链霉菌过氧化物酶和化学发光底物通过感光膜产品的检测。设置和低耗材成本，这种技术成本低廉（约每样本2美元），高吞吐量（可同时处理多个膜），有一个很短的周转时间（约10小时）。
该技术可以通过多种方式利用。设计多个探针，可在一个单一的扩增产物的序列变异检测，或多个产品可以被放大，同时，与一个（或多个）用于后续检测探头，。结合这两种方法也可以用来在一个单一的检测。包括一个单一的目标序列的多个探头的能力，使检测具有高度特异性。
MPCR / RLB发布的应用程序包括抗生素耐药性的基因1,2的检测，耐甲氧西林的金 黄色 葡萄球菌 3-5和沙门氏菌 SP 6，血清型的肺炎链球菌，无 乳链球菌 9 7,8和肠道病毒10,11，鉴定的分子打字分枝杆菌 ，检测生殖器13日至15日和 16和呼吸道等17个病原体检测和鉴定mollicutes 18 SP 12。然而，该技术的多功能性手段的应用几乎是无限的，而不是仅限于微生物的分子分析的。
MPCR / RLB的五个步骤a）引物和探针设计，B）DNA提取和PCR扩增C）膜的制备，D）杂交和检测，E）膜的再生。
Protocol
引物和探针的设计必须给予认真考虑。应该利用所有可用的序列从GenBank中，如数据库的兴趣目标，以确定合适的目标的保护区。大量的目标是在一个单一的MPCR检测扩增的，应该是每个扩增序列的长度相近，不应超过300个碱基对，以避免竞争。该方法的另一种应用是放大一个更长的目标，使用对保守区域的引物，并使用多个探针来识别的扩增序列变异。在这种情况下，扩增的PCR产物可能会更长。引物退火温度应该都是相似的，PCR条件进行相应的调整。应避免形成强大的二级结构或引物二聚体的引物。可以使用的Sigma Aldrich公司的DNA计算器（ http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ），可靠地预测这些功能。
DNA探针的设计应具有退火温度接近60 ° C。为了最大限度地提高特异性，两个探头可以为每个感兴趣的目标包括在实验中，杂交正向相邻的反向引物结合位点的DNA链，和其他正向引物结合位点附近的反向链。在这种情况下，正向和反向引物必须在生物素修饰的。如果只有一个探头每扩增目标正在使用，那么只需要一个引物生物素修饰。
当设计MPCR / RLB检测的引物和探针，它强烈建议，在硅片的方法来预测的PCR产物与探针杂交与体外实验结果的关联。理想情况下，这是使用的全基因组序列是可用的分离。 FastPCR（http://primerdigital.com/fastpcr.html），如软件，可以用于此目的。可以预见，在硅片分析表明碱基对的不匹配，造成低探针退火温度探头信号弱或无。
DNA的提取技术，将不同取决于被测试的样本，PCR条件将依赖于引物设计。读者可参照个别检测的出版物更多关于DNA提取和PCR试 剂和条件 1-19信息。
每个检测运行适当的控制，提供至少一个正极和一个细胞膜上的每个探头的负面探针的信号，以及免费的DNA控制。此外，它是有益的，包括在顶部的膜，预计将所有的样品（如：一个物种或一个微生物属特异性探针）的积极一个探头。这可作为阳性对照探针，但也允许容易取向的结果。
1。膜的制备
- 准备了以下解决方案：
- 100毫升0.5M碳酸氢钠（pH值8.4）
- 100毫升0.5M碳酸氢钠3
- 20毫升16％的经发会
- 250毫升0.1 M的氢氧化钠
- 250毫升2xSSPE
- 250毫升2xSSPE/0.1％SDS - 在60 ° C水浴地方
- 250毫升20 mM的EDTA。
- 预热烤箱至60 ° C。
- 用70％乙醇的清洁Immunetics Miniblotter。
- 稀释在0.5 M的碳酸氢钠3寡核苷酸探针的终浓度为2 pmol /μL和200μL的体积。
- 剪下一个15x15厘米BiodyneC的尼龙膜。使用铅笔和直尺，规则跨越膜的顶部0.5厘米的空间，在这里写的详细信息。
- 刚在20毫升的塑料袋密封膜在室温下10分钟16％EDAC的解决方案和岩石。
- 膜在去离子水冲洗30秒。
- 将膜miniblotter与运行的通道穿过细胞膜（铅笔线平行）。把支持地方和接近吸墨纸垫。从渠道吸液。
- 填写与150μL0.5 M的碳酸氢钠3泳道1和45。使用150μL，每个探头解决方案，以填补序列2-44车道，要小心，以避免气泡。如果气泡出现在通道中，在保持吸液管，迅速吸出解决方案，让气泡浮到吸管的顶端，然后重试。在室温下孵育5分钟。
- 吸探针解决方案，除去膜和250毫升0.1 M的氢氧化钠在室温下洗9分钟。
- 在250毫升2xSSPE清洗膜30秒。
- 在250毫升的预热2xSSPE/0.1％SDS在烤箱清洗膜在60℃，5分钟。
- 如果不立即用于杂交，洗膜在室温为20分钟（保留余下10毫升）在240毫升20 mM的EDTA，然后密封在塑料袋中剩下的10毫升20 mM的EDTA和STOR膜e在冰箱在4 ° C
- Pyroneg洗涤剂和刷子清洗miniblotter。冲洗并晾干。
2。杂交及检测
- 准备了以下解决方案：
- 250毫升2xSSPE/0.1％SDS - 水浴存放在60 ° C。
- 500毫升2xSSPE/0.5％SDS - 水浴存放在60 ° C
- 500毫升2xSSPE/0.5％SDS - 烤箱存放在42 ° C
- 500毫升2xSSPE - 保持室温
- 500毫升1％的SDS - 存储在水浴60 ° C最初（步骤3）
- 250毫升20 mM的EDTA - 在室温下储存（步骤3）。
- 打开一个烤箱，在60 ° C和一个烤箱42 ° C。把水烧开，在烤盘上一个大烧杯。
- 用70％乙醇Miniblotter清洁Immunetics。
- 2xSSPE/0.1％SDS成一个小容器分装10毫升。每个PCR产物中加入20μL到150μL2xSSPE/0.1％SDS编号管。
- 煮沸10分钟，PCR产物在100℃使用发泡胶持有人。立即置于冰上至少5分钟。
- 洗膜，在其余240毫升2xSSPE/0.1％SDS在60 ° C的烤箱5分钟。
- 将膜垫与支持miniblotter。定位使渠道运行垂直（垂直铅笔线）。
- 多余的液体吸miniblotter渠道。
- 其余150μL2xSSPE/0.1％SDS第一个和最后一个渠道。加水煮其余通道（2-44）序列的PCR产物，要小心，以避免气泡。
- 广场miniblotter持平在60℃，1小时的烤箱，让杂交发生。
- 吸液从每个通道，然后从miniblotter膜。
- 在60℃10分钟的烤箱预热250毫升2xSSPE/0.5％SDS清洗两次。
- 浸湿尼龙分离网状2xSSPE/0.5％SDS在42 ° C，并用它来卷起膜。
- 地方卷起到辊筒膜，平展，以确保膜紧靠内表面。添加3μL链霉菌过氧化物酶的共轭（罗氏应用科学部）42至15毫升2xSSPE/0.5％SDS℃，辊筒。紧紧螺丝帽和孵化辊炉在42 ° 60分钟的彗星。确保卷的方向是，使膜不收紧。定期检查是否有泄漏。
- miniblotter Pyroneg洗涤剂和水清洗，冲洗并晾干。
- 从辊筒膜。其余2xSSPE/0.5％SDS在42 ° 10分钟两次清洗。
- 在室温下清洗两次在2xSSPE为5分钟。
- 打开烤箱高达80 ° C和地方500毫升1％SDS在烤箱预温。
- 15毫升Amersham公司的ECL检测解决方案（7.5溶液A和溶液B的7.5毫升）。放弃2xSSPE和添加检测解决方案。摇滚手轻轻为2分钟，确保完全覆盖膜与解决方案。丢弃化学发光的解决方案。
- 切两片塑料的透明度，以适应曝光墨盒。将膜之间的两片和地点到曝光墨盒。
- 进入暗室。红灯下，加ECL检测膜盒和公开为5分钟。电影狗耳后拆除的右上角，以便正确的方向观看时。
- 制定与自动化开发或生产商的方向的化学浴电影。
- 如果需要，或长或短的曝光时间，重复曝光。
3。膜的再生
- 洗膜在250毫升1％SDS在80℃，30分钟两次。
- 15分钟，在室温下洗膜在240毫升20毫米EDTA。
- 塑料袋密封膜用10 ml 20 mM的EDTA和冷藏在4 ° C为今后的再利用。
4。代表结果：
结果是最好的观看电影放在印刷电网，否则扫描图像，并导入到软件，如BioNumerics（应用数学，圣马尔滕斯 - Latem，比利时）。每个探测结果的解释应该参考阳性和阴性对照探针。结果是最好的等级为阴性，弱或阳性。积极的结果，其中的信号是强或强于阳性对照探针。阴性结果是信号不存在或等于阴性对照组（背景信号的情况下）。弱的结果是信号比阳性对照探针暗，但强于阴性对照。业绩疲软可能会导致探头约束力薄弱，或由于非特异性引物二聚体的形成信号的点突变的结果。使用两个探头每利益目标可以改善的特殊性，在一个单一的薄弱结果可以安全地解释非特异性信号。如果有任何疑问仍然存在，单丛PCR反应，可以执行任何放大器的凝胶为基础的检测和测序lified决定，如果结果是真正积极的产品。一个代表性的结果如图2所示。
图1。MPCR / RLB原则（P1）的步骤1.9。胺改性探针共价结合的尼龙膜。 （P2）步骤2.10。生物素修饰的PCR产物杂交探针。 （P3）步骤2.14。过氧化物酶标记的链霉亲和，是培养与膜结合，以生物素。 （P4），步骤2.19-2.21。过氧化物酶催化ECL检测试剂的反应，产生光的光感光胶片曝光。膜，然后洗净，再利用。
图2。代表MPCR / RLB的结果。 1至6个样品，代表阳性对照 - 它们之间存在的43个探头，每年至少有一个积极的探测信号。每一个目标序列（一个通过U）是两个不同的探头，以最大限度地提高特异性检测。探头A1和A2分别代表特定物种，预计每个样品要积极协助电影与定向探头。探头A1是在膜的底部反复。样品7日和8负的控制。注意探头第一季度，第二季度，T1和T2阴性对照的信号，表明可能非特异性结合的引物或引物二聚体产品。这些探针或引物将需要重新设计。探头C1，D1和F1显示裸奔穿过细胞膜可能是由于一些非特异性的链霉菌过氧化物酶结合物或化学发光底物摄取，但是这是很容易区分真正的积极的探测信号。探头D1和D2有其他探测器相比，相对较弱的信号，这可能是由于大型扩增产物，导致效率较低的放大。探头J2是否定的是几个样品（1，3，4，6，39）探头J1的是积极的。这很可能代表了这些样品的J2的结合位点的突变。
Discussion
MPCR / RLB方法，可同时检测大量的PCR扩增。由于高灵敏度的化学发光探针为基础的检测，一个单一的大量的引物对多重PCR反应，可用于放大DNA为模板。
如果没有探测信号与一个或多个样品，任何剩余的PCR产物进行凝胶电泳，获得可以帮助区分的问题是否与PCR扩增或探针杂交。膜的所有探头信号弱或缺席，但凝胶电泳显示PCR扩增成功，可能性包括膜标签的问题，膜后，以前使用的不正确的再生，在杂交或链霉亲和孵化不正确的温度，或有缺陷的链霉过氧化物酶结合物或检测试剂。
如果控制样本表明，个别探头可产生假阴性信号，单用凝胶为基础的检测和随后的测序PCR，可以进行验证的PCR产物的扩增和探针结合位点序列变异看。薄弱或者根本没有探头的信号，可能是由于大量扩增大小：所有的扩增产物，如果可能的话应该是类似的长度小于300 bp的。扩增产物中的DNA结构也可能产生探头约束力差，可能需要重新设计引物。个人引物或探针浓度也可能是多种多样的，以优化信号强度。
假由于探头nonamplified引物或引物二聚体产品具有约束力的积极信号，可以调查由执行单一的PCR扩增与凝胶检测和随后的测序。如果发生这种情况，重新设计的探头，可能是必要的。在探针结合位点的点突变可能会导致薄弱或者根本没有信号。允许每个扩增产物的两个探头，使得这种不易察觉的。可利用这一特点，小心的引物和探针的设计，检测目标DNA的小序列变异。
综上所述，虽然有许多产品检测以下多重PCR反应方法，MPCR / RLB低安装成本高吞吐量和廉价的优势。该方法的灵活性，允许其使用了广泛的应用。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
马修奥沙利文和周飞是澳大利亚国家卫生和医学研究理事会研究生医学研究奖学金的受助人。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5’ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm | Pall Corporation | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche Group | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice | |||
| Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay. | |||
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film | ||
| Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay. | |||
References
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