Summary
Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (
Abstract
Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (Тс TERT) и восстановление активного Т. castaneum теломеразы рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс в пробирке.
Теломераза является специализированным обратной транскриптазы 1, который добавляет коротких повторов ДНК, называемые теломеры, до конца 3 'линейных хромосом 2, которые служат для защиты их от конца в конец синтеза и деградации. После репликации ДНК, короткий сегмент потерял в конце хромосомы 3 и без теломеразы, клетки продолжают деления пока в конце концов достигая своего Хейфлика Предельная 4. Кроме того, теломеразы является бездействующим в большинстве соматических клеток 5 у взрослых, но принимает активное участие в раковые клетки, 6, где он способствует ячейки бессмертии 7.
Минимальный фермент теломераза состоит из двух основных компонентов: белков субъединицы (трет), в состав которого входят каталитическая субъединица фермента и компонентов интегральной РНК (TER), который содержит шаблон TERT использует для синтеза теломер 8,9. До 2008 года только структуры для отдельных доменов теломеразы была решена 10,11. Прорыв в этой области пришли из определения кристаллической структуры активных 12, каталитические субъединицы Т. castaneum теломеразы, Тс TERT 1.
Здесь мы представляем методы получения большого количества активных, растворимые TERT Тс для структурных и биохимических исследований, а также восстановление комплекса теломеразы RNP в пробирке для анализов активности теломеразы. Обзор экспериментальных методов, используемых показано на рисунке 1.
Protocol
1. Экспрессия рекомбинантного Тс TERT
- Привить 6 л 2YT СМИ (6 х 2 л Расстроенный колб Эрленмейера, содержащих 1 л бульона 2YT в каждой) из шести свежих пластин преобразуется Rosetta (DE3) pLysS клеток, содержащих синтетические Тс TERT плазмиду с ТРВ расщепляемого N-терминал hexahistidine- тег.
- Рост клеток при 37 ° C при встряхивании при 220 оборотов в минуту до OD 600 из 0,5-0,6.
- Вызвать экспрессию белка путем добавления 1 мМ IPTG.
- Уменьшить температуру до 30 ° С, медленно покачивая до 150 оборотов в минуту, и позволяют клеткам, чтобы выразить белка в течение 4-5 ч.
- Урожай клетки центрифугированием при 4 ° С и 3500 оборотов в минуту в течение 30 мин.
- Ресуспендируют каждый 1 л осадок клеток в 20 мл буфера, содержащего 25 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 0,5 М KCl, 15 мМ имидазола, 5 мМ β-меркаптоэтанол и 0,1 мМ фенилметил фторид сульфонил (PMSF) и benzamidine.
- Flash Freeze ресуспендировали ячейки смеси медленно капает клеток в 50 мл пластиковых коническую трубку с жидким азотом, чтобы каждая капля замерзает при ударе в жидком N 2. Магазин замороженных клеток при -80 ° С до готовности для очистки белков.
2. Очистка Тс TERT
- Оттепель клетки при комнатной температуре до жидкой консистенции не будет достигнуто, а затем перейти к металлу стаканы на льду в течение ультразвуком.
- Разрушать ультразвуком клетки на льду в течение 2 мин с интервалом 30 с 30-секундной паузы, примерно в 51 Вт мощности.
- Спином вниз лизированных клеток на 18000 оборотов в минуту в течение 20 мин для разделения растворимых и нерастворимых белковых фракций и осторожно удалите супернатант для никель аффинной хроматографии.
- Равновесия Ni-NTA (никель-нитрилотриуксусная кислота) столбец с буфером, содержащим 25 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 0,5 М KCl, 15 мМ имидазола, 5 мМ β-меркаптоэтанол и 0,1 мМ PMSF и benzamidine.
- Нагрузка супернатант за смолы и собирать течь через.
- Промыть колонку с буфером, содержащим 25 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 500 мМ KCl, 15 мМ имидазола, 5 мМ β-меркаптоэтанол и 0,1 мМ PMSF для удаления остатков и неспецифически связанных белков.
- Элюировать Тс TERT из Ni-NTA смолы использованием градиента имидазола 15 - 300 мм и собрать 3 мл фракций для анализа СТРАНИЦА SDS.
- Используйте СТРАНИЦА анализ чтобы определить, какие фракции содержат Тс TERT белка и концентрат этих фракций в Amicon 30 кДа (Millipore) фильтра.
- Концентрат Тс TERT фракций в объеме менее 10 мл для дальнейшей очистки.
- Тс TERT далее очищают на катионообменной колонки (HS Порос, Applied Biosystems), предварительно уравновешенной буфером, содержащим 25 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 500 мМ KCl, 1 мМ DTT.
- Нагрузка белка смеси на колонке HS пористости и промойте его, чтобы удалить все белки и нуклеиновые кислоты загрязнений.
- Промыть колонку с буфером, содержащим 500 мМ KCl следуют 700 мМ KCl для удаления оставшихся загрязнителей.
- Элюции белка Т TERT из колонки HS пористости с 1 буфера M KCl. На данный момент белка должна быть более 99% чистой.
- Удалите все белковых агрегатов, передавая белка более Superdex-200 размера колонки (размер хроматографии - GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером, содержащим 25 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 500 мМ KCl, и 1 мМ TCEP.
3. Tribolium castaneum жука культуры
- Т. castaneum жуков, где первоначально предоставил в дар от д-р С. Браун, отдел биологии в Университете штата Канзас.
- Начало Т. castaneum культуры, добавив сто взрослых жуков, чтобы контейнер с 28,5 г муки и 1,5 г сушеных дрожжей хлебопекарных.
- Магазин Жук культур при комнатной температуре и в темных, сырых местах, в течение трех-четырех недель, чтобы обеспечить воспроизводство и рост. Место стакан с водой в области хранения жука для обеспечения влажной среде.
- Урожай личинок жуков, сколько необходимо для выделения РНК. Разрешить оставшиеся личинки, чтобы созреть для взрослых, держа их в той же культуре.
- Каждый месяц, передача наиболее активных жуков (не более сотни) в новую колбу, содержащую свежие муку и дрожжи, чтобы пополнить свои продукты питания.
4. Т. castaneum Всего РНК изоляции
- Урожай 20 личинок жуков из культуры (каждая культура должна содержать от 500-1000 личинки), отделив их от взрослых жуков и муки / дрожжевой культуры. Ликвидация мука или дрожжи частиц придает жуков перед измельчением их.
- Стерилизовать скамейке области, миномет, и пестик (рассмотреть лечении перчатки, а), используемых для этой процедуры с RNaseZap (Амбион, Inc), чтобы удалить все следы рибонуклеаз перед помолом жуков.
- Grind личинки в жидком N 2 в мелкий порошок, используя ступку и пестик и тransfer порошка на 50 мл центрифужную пробирку, сохраняя при этом жидким N 2, чтобы порошок остается в замороженном виде до буфера для экстракции добавляется.
- Разрешить лишней жидкости N 2 испаряться из порошка. После жидкого N 2 испарилась, гомогенизации жука порошка в 200 мкл буфера для экстракции (за 20 личинок жуков), содержащего 25 мМ Трис-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ benzamidine, 200 мМ KCl, 10 % глицерин, 10 мМ имидазола и 20U из RNasin, рН 7,5 и инкубируют на льду в течение 30 минут.
- Центрифуга гомогената при 15000 оборотов в минуту в течение 20 минут при 4 ° С, собирают супернатант и флэш заморозить в жидком образце N 2. При необходимости образцы могут храниться при температуре -80 ° С в течение ночи.
- Извлечение общую РНК с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen).
5. В пробирке восстановление теломеразы castaneum Tribolium
- Смешайте 20 мкг рекомбинантного Его с метками Тс TERT с 50 мкл Т. castaneum общей РНК в связывании буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, 200 мМ KCl, 10% глицерина, 5 мМ β-меркаптоэтанола и 10 мМ имидазол, рН 7,5.
- Инкубируйте Тс TERT - общей смеси РНК в течение двух часов при температуре 22 ° С в Т. castaneum лизат в присутствии RNasin ингибитора для предотвращения деградации РНК.
- Purify комплекс над Ni-NTA колонке для удаления примесей лизат и избыток РНК.
6. Теломераза повторить усиления протокол (TRAP) анализы
- Смешайте 4 мкг Ni-NTA очищенный Т. castaneum теломеразы в 50 мкл буфера, содержащего 20 удлинение мМ Трис-HCl (рН - 8,3), 7,5 мМ MgCl 2, 63 мМ KCl, 0,05% Твин-20, 1 мМ EGTA, 0,01% БСА, 0,5 дНТФ мм, 1 мкМ TCAS-TS ДНК-праймера (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), и инкубировать смеси при температуре 30 ° С в течение 60 минут, чтобы дать удлинение TCAS-TS ДНК грунтовки, не восстановленные Т. castaneum теломеразы.
- Извлечение удлиненные одноцепочечных ДНК (оцДНК), добавляя равный объем фенола хлороформа в реакционной смеси. Встряхните смесь мягко, пока эмульсия является однородной.
- Центрифуга образца при 12 000 оборотов в минуту в течение пяти минут при температуре 4 ° С до отдельных оцДНК от загрязнений.
- Передача верхнего водного слоя образца в 1,5 мл трубки Эппендорф, добавить конечной концентрации 10 мМ NaOAc (рН 5,0), 1 мМ MgCl 2, а 66,4% этанола, а затем позволить образец для осаждения в течение ночи при температуре -20 ° C.
- Спиновые образца при 15000 оборотов в минуту в течение тридцати минут при 4 ° С до гранул осажденный оцДНК. Декантируйте решение с помощью пипетки, а затем добавить 200 мкл 70% этанола на образец, чтобы вымыть оставшиеся NaOAc и MgCl 2 из образца. Центрифуга образец в течение пяти минут при той же скорости и температуры повторно гранул образца.
- Декантируйте решение EtOH использованием дозаторов и удалить оставшиеся следы этилового спирта, позволяя трубку Eppendorf для инкубации открытым при комнатной температуре в течение трех минут. Имея этанола в образце будет мешать шаг ПЦР.
- Ресуспендируют оцДНК гранул (содержащий теломеразы удлиненные продукта и TCAS-TS грунтовка) в 50 мкл ПЦР-реакции буфера, содержащего 10 мМ Трис-HCl (рН 8), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 100 мкМ дНТФ (дАТФ, дГТФ и dTTP), 10 мкМ [32 P] дЦТФ, 1 мкМ TCAS-CX праймера (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') и 1,25 U Taq ДНК-полимеразы.
- ПЦР усиливают теломеразы удлинение продукты (29 циклов 94 ° С в течение 30 секунд, 50 ° С в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты), чтобы они были видны на 12% полиакриламидном геле.
- Предварительно запустить 12% гель с Трис-борат-ЭДТА (КЭ), работающих буфера, содержащего 44,5 мМ Трис, 44,5 мМ борная кислота, 1 мМ ЭДТА, рН 8 в течение тридцати минут до запуска ПЦР образцов. После предварительного запуска и загрузки гель с ПЦР, запустите гель на 185 вольт в течение 1,5-2 часов при 4 ° С или на льду.
- Сухой гель и использовать пластины фосфора изображений для визуализации активности.
7. Представитель Результаты:
Примером очищенной Тс TERT после размер хроматографии показано на рисунке 2. Белка концентрированный после очистки запускается на 12% SDS-полиакриламидном геле и показано, что более 99% чистой (рис. 2А). Размер исключения (S200) хроматограмме также предоставляется (рис. 2Б), чтобы продемонстрировать чистоту и отсутствие агрегатов из очищенного белка образца. Выход 5 мг белка после очистки все шаги были выполнены, как правило, получить хотя конечный выход может меняться.
Анализ представитель Ловушка для восстановленного Т. castaneum теломераза показано на рисунке 3, как ранее сообщал Митчелл и соавт. 12. Поэтапный лестнице теломеразы продукции можно увидеть в переулок 1, однакоони отсутствуют в обоих РНКазы лечение теломеразы и TERT активного центра мутант (D251A) образцов на дорожках 2 и 3 соответственно.
Рисунок 1. Блок-схема этапов воссоздания рекомбинантный Тс TERT. Во-первых, рекомбинантный Тс TERT чрезмерно выраженной в Е. палочки. Белок затем очищают никеля, катионного обмена и хроматографии исключения. Т. castaneum жуков культивируют в доме и их личинок, которые используются для изоляции общей РНК. Очищенной Тс TERT и общей РНК затем смешиваются воссоздать сложный теломеразы RNP, и последующие анализ TRAP используется для подтверждения комплекс РНП активной теломеразы.
Рисунок 2. Размер хроматограмме изоляции и SDS PAGE анализ белка Т TERT. () 12% SDS-полиакриламидном геле белка Т TERT после размеру хроматографии. Белком Тс TERT (70 кДа) мигрирует быстрее на геле SDS PAGE поскольку он имеет высокую изоэлектрической точки (PI - 9,8). (В) Размер исключения хроматограмме (Superdex S200) белка Т TERT.
Рисунок 3. TRAP анализы в пробирке восстановленного Tribolium castaneum теломеразы адаптировано из Митчелл и соавт. 12. Полоса 1: дикого типа Т TERT и общей РНК, выделенной из личинок жука. Переулок 2: дикого типа Т TERT и РНКазы лечение личинками общей РНК и клеточные экстракты. Лейн 3: активный центр мутанта Т TERT (D251A) и личинки жуков РНК общего личинок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь позволяет производить большие объемы каталитической субъединицы Т. castaneum теломеразы TERT в растворимой, активной формы для структурных и биохимических исследований. Метод Тс TERT чрезмерное выражение чувствительны к тонким изменениям температуры или плотности клеток от заявленных выше, и может существенно повлиять на уровни экспрессии белка. В частности, мы обнаружили, что индуцирование клеток для экспрессии белка до оптической плотностью до 0,5 при 600 нм, или понижение температуры до 30 ° C до индукции, приводит к значительному снижению выход белка.
С точки зрения очистки белков ТС TERT имеет основные изоэлектрической точки (PI - 9,8), и поэтому его способностью связывать плотно катионообменной колонки могут быть использованы для получения чистого образца белка путем загрузки и стиральные образца с высоким содержанием соли концентрациях. Если белок должны были низкими изоэлектрической точки (PI <5) этот протокол может быть адаптирована путем замены катионообменных для анионообменной колонке, и повторно оптимизировать мыть условий для достижения лучших белка чистоты.
В сборке фермент, метод, описанный здесь, только частичное восстановление теломеразы холофермента, поскольку он не содержит никаких теломеразы связанных белков. Хотя эти компоненты отсутствуют, восстановленные теломеразы, состоящей из рекомбинантных Тс TERT и общей РНК из T. castaneum личинки активно, как показано на рисунке 3. Уникальные способности теломеразы, чтобы добавить несколько одинаковых повторений, чтобы концы хромосом, процесс, известный как Повторите Processivity Сложение, могут быть визуализированы на лестнице продукции в TRAP геля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследования, представленные здесь была поддержана Пенсильвании Департамент здравоохранения, Эллисон Медицинская, V и Изумрудный фондов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
