Summary
الجهود المبذولة لعزل الوحيدات الحفاز تيلوميراز ، TERT بكميات تكفي لدراسات الهيكلية ، وقد اجتمع مع نجاح محدود لأكثر من عقد من الزمان. هنا ، نقدم طرائق عزل TERT المؤتلف castaneum خنفساء الدقيق (
Abstract
الجهود المبذولة لعزل الوحيدات الحفاز تيلوميراز ، TERT بكميات تكفي لدراسات الهيكلية ، وقد اجتمع مع نجاح محدود لأكثر من عقد من الزمان. هنا ، نقدم طرائق عزل TERT المؤتلف castaneum خنفساء الدقيق (TC TERT) ، وإعادة تشكيل T. نشط castaneum تيلوميراز بروتين نووي ريبوزي (RNP) المعقدة في المختبر.
تيلوميراز هو الناسخ العكسي المتخصصة (1) الذي يضيف تكرار الحمض النووي قصيرة ، ودعا التيلومير ، لانهاء 3 'من الكروموزومات 2 الخطية التي تعمل على حمايتهم من نهاية إلى نهاية الانصهار وتدهورها. بعد تكرار الحمض النووي ، يتم فقدان قطعة قصيرة في نهاية الكروموسومات (3) ودون تيلوميراز ، مواصلة تقسيم الخلايا حتى يصل في النهاية على حد Hayflick 4. بالإضافة إلى ذلك ، هي نائمة تيلوميراز في الخلايا الجسمية 5 في معظم البالغين ، ولكنه نشط في الخلايا السرطانية 6 حيث أنه يعزز الخلود الخلية 7.
انزيم تيلوميراز الحد الأدنى من المكونات الأساسية يتكون من اثنين : الوحيدات البروتين (TERT) ، الذي يتألف من الوحيدات الحفاز للانزيم وعنصرا لا يتجزأ الحمض النووي الريبي (تير) ، والذي يحتوي على TERT القالب يستخدم لتجميع التيلوميرات 8،9. قبل 2008 ، قد تم حلها فقط عن هياكل المجالات تيلوميراز الفردية 10،11. وجاء تقدم كبير في هذا المجال من تحديد التركيب البلوري لل12 نشاطا ، الوحيدات الحفاز T. castaneum تيلوميراز ، TC TERT 1.
هنا ، فإننا نقدم طرق لإنتاج كميات كبيرة من النشطة ، TERT التكنيشيوم ذوبان للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية ، وإعادة تشكيل لتيلوميراز معقدة RNP في المختبر لفحوصات نشاط التيلوميراز. ويظهر لمحة عامة عن الطرق التجريبية المستخدمة في الشكل 1.
Protocol
1. التعبير عن المؤتلف TERT التكنيشيوم
- تطعيم 6 لتر من وسائل الاعلام 2YT (6 × 2 لتر حير قوارير مخروطي يحتوي على 1 لتر من مرق 2YT في كل) من ست لوحات جديدة من الخلايا تحولت pLysS روزيتا (DE3) التي تحتوي على البلازميد TERT التكنيشيوم الاصطناعية مع محطة N - شطورة TEV - hexahistidine العلامة.
- تنمو الخلايا على 37 درجة مئوية في حين تهتز في الدقيقة 220 إلى 600 من 0،5-0،6 OD.
- حمل بروتين تعبير بإضافة IPTG 1 ملم.
- خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية ، وبطء الهز إلى 150 دورة في الدقيقة ، والسماح للتعبير عن خلايا البروتين لح 4-5
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية و 3500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- Resuspend كل خلية L 1 بيليه في 20 مل من العازلة التي تحتوي على 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، الجلسرين 10 ٪ ، و 0.5 M بوكل ، إيميدازول 15 ملم ، 5 ملم β - المركابتويثانول ، و 0.1 ملي فلوريد sulphonyl phenylmethyl (PMSF) وbenzamidine.
- فلاش تجميد معلق خليط الخلية التي تتساقط ببطء الخلايا في أنبوب 50 مل مخروطية بلاستيكية مملوءة النيتروجين السائل حتى يتجمد كل قطرة على التأثير في السائل N 2. تخزين الخلايا المجمدة في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لتنقية البروتين.
2. تنقية TERT التكنيشيوم
- يتم التوصل إلى ذوبان الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى التناسق السائل والانتقال بعد ذلك إلى الأكواب المعدنية على الجليد لصوتنة.
- يصوتن الخلايا على الثلج لمدة 2 دقيقة في 30 ثانية مع فترات توقف 30 ثانية ، في حوالي 51 واط من الطاقة.
- تدور باستمرار خلايا lysed في 18000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة لفصل أجزاء من البروتين للذوبان وغير القابلة للذوبان وإزالة بعناية طاف اللوني للتقارب النيكل.
- ويوازن ني NTA (النيكل nitrilotriacetic حمض) مع العمود العازلة التي تحتوي على 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، الجلسرين 10 ٪ ، و 0.5 M بوكل ، 15 إيميدازول ملم ، 5 ملم β - المركابتويثانول ، و 0.1 ملي PMSF وbenzamidine.
- تحميل طاف على الراتنج وجمع من خلال التدفق.
- غسل العمود مع العازلة التي تحتوي على 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، الجلسرين 10 ٪ ، 500 مم بوكل ، إيميدازول 15 ملم ، 5 ملم β المركابتويثانول ، و 0.1 ملي PMSF لإزالة جميع البروتينات المتبقية وعلى وجه التحديد غير محدد.
- أزل التكنيشيوم TERT من راتنج ني NTA باستخدام التدرج إيميدازول من 15 -- 300 مم ، وجمع الكسور 3 مل لتحليل SDS PAGE.
- استخدام صفحة تحليل لتحديد الكسور التي تحتوي على البروتين والتكنيشيوم TERT تركز هذه الكسور في Amicon 30 كيلو دالتون (ميليبور) التصفية.
- تركز التكنيشيوم الكسور TERT إلى حجم أقل من 10 مل لتنقية أخرى.
- كذلك تتم تنقيته TERT التكنيشيوم فوق العمود الموجبة لتبادل (HS بوروس ، النظم البيولوجية التطبيقية) قبل معايرتها مع العازلة التي تحتوي على 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، الجلسرين 10 ٪ ، 500 بوكل مم ، و 1 DTT ملم.
- تحميل مزيج من البروتين على العمود بوروس HS وغسله لإزالة كافة الملوثات البروتين والحمض النووي.
- غسل العمود مع العازلة التي تحتوي على 500 ملي بوكل تليها 700 ملم بوكل لإزالة أي ملوثات المتبقية.
- أزل البروتين TERT التكنيشيوم قبالة العمود بوروس HS مع 1 العازلة بوكل M. في هذه النقطة يجب أن يكون البروتين اكثر من 99 ٪ نقية.
- إزالة أي مجاميع البروتين عن طريق تمرير هذا البروتين أكثر من عمود التحجيم Superdex - 200 (حجم الاستبعاد اللوني -- جنرال الكتريك للرعاية الصحية) ، قبل معايرتها مع العازلة التي تحتوي على 25 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، الجلسرين 10 ٪ ، 500 مم بوكل ، و 1 TCEP ملم.
3. خنفساء الدقيق الثقافة castaneum خنفساء
- وT. castaneum الخنافس حيث قدمت في البداية باعتبارها هدية من الدكتور س. براون ، قسم الأحياء ، جامعة ولاية كنساس.
- بدء T. ثقافة castaneum بإضافة 100 الخنافس الكبار في وعاء مع 28.5 غرام من الطحين و 1.5 غرام من الخميرة المجففة للخباز.
- مخزن الثقافات خنفساء في درجة حرارة الغرفة وفي بيئة مظلمة ورطبة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع للسماح للتكاثر والنمو. مكان دورق يحتوي على المياه في منطقة التخزين خنفساء لضمان بيئة رطبة.
- حصاد يرقات الخنفساء حسب الحاجة لعزل الحمض النووي الريبي. السماح لتنضج اليرقات المتبقية للبالغين ، والاحتفاظ بها في نفس الثقافة.
- كل شهر ، ونقل الخنافس الأكثر نشاطا (أي أكثر من مئة) في قارورة جديدة تحتوي على الطحين والخميرة الطازجة لتجديد الإمدادات الغذائية.
4. ت. castaneum إجمالي RNA العزلة
- يرقات الخنفساء الحصاد 20 من ثقافة (كل ثقافة يجب أن تحتوي على ما بين 500-1000 اليرقات) التي تفصلها عن الخنافس الكبار وثقافة الطحين / الخميرة. القضاء على الطحين أو جزيئات الخميرة التي تعلق على الخنافس قبل طحن لهم.
- تعقيم المنطقة مقاعد البدلاء ، ومدافع الهاون ، وعلى مدقة (النظر في معالجة قفازات كذلك) المستخدمة لهذا الإجراء مع RNaseZap (Ambion ، المؤتمر الوطني العراقي) لإزالة جميع آثار ribonucleases قبل طحن الخنافس.
- طحن اليرقات في السائل N 2 الى مسحوق ناعم باستخدام قذائف الهاون والمدقه و transfer مسحوق لأنبوب الطرد المركزي 50 مل مع الحفاظ على السائل N 2 للتأكد من أن مسحوق مجمدة حتى يتم إضافة العازلة الاستخراج.
- تسمح السائل الزائد N 2 لتتبخر من مسحوق. بعد N 2 السائل قد تبخرت ، التجانس مسحوق خنفساء في 200 ميكرولتر من استخراج العازلة (لكل يرقات الخنفساء 20) تحتوي على 25 مم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 5 ملي β - المركابتويثانول ، 1 ملم EGTA ، 0.1 ملي benzamidine ، 200 ملي بوكل ، 10 الجلسرين ٪ ، 10 ملي إيميدازول و20U من RNasin ، ودرجة الحموضة 7.5 واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 15000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية ، وجمع وطاف فلاش تجميد العينة في السائل N 2. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية خلال الليل.
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام RNeasy ميني كيت (Qiagen).
5. إعادة في المختبر من تيلوميراز castaneum خنفساء الدقيق
- مزيج من 20 ميكروغرام المؤتلف TERT - TC لها صاحب الموسومة 50 ميكرولتر من T. RNA castaneum الكلي في المنطقة العازلة التي تحتوي على 25 مم ملزم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 200 ملي بوكل ، الجلسرين 10 ٪ ، 5 ملم β - المركابتويثانول ، و 10 ملي إيميدازول ، ودرجة الحموضة 7.5.
- لاحتضان TERT TC -- مجموع RNA الخليط لمدة ساعتين عند 22 درجة مئوية في T. castaneum lysate في وجود المانع RNasin لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.
- تنقية معقدة أكثر من عمود ني NTA لإزالة الشوائب وlysate RNA الزائدة.
6. بروتوكول تيلوميراز التضخيم تكرار (TRAP) المقايسات
- مزيج 4 ميكروغرام من T. المنقى ني NTA تيلوميراز castaneum العازلة في 50 ميكرولتر استطالة تحتوي على 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة -- 8.3) ، 7.5 ملي MgCl 2 ، 63 مم بوكل ، 0.05 ٪ توين 20 ، 1 ملم EGTA ، BSA 0.01 ٪ ، dNTPs 0.5 مم ، 1 ميكرومتر TCAS - TS التمهيدي الحمض النووي (5' - AAGCCGTCGAGCAGAGTC - 3 ') ، واحتضان الخليط حتى 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة للسماح للاستطالة التمهيدي TCAS DNA - TS التي أعيد تشكيلها T. castaneum تيلوميراز.
- استخراج ممدود واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) عن طريق إضافة حجم مساو من الفينول كلوروفورم إلى خليط التفاعل. يهز الخليط برفق حتى المستحلب متجانسة.
- العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في 4 درجات مئوية في فصل ssDNA من الملوثات.
- نقل مائي الطبقة العليا من العينة إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف ؛ إضافة تركيز النهائي من NaOAc 10 ملم (5.0 درجة الحموضة) ، 1 ملم MgCl 2 ، و ٪ 66.4 EtOH ومن ثم السماح لترسيب العينة بين عشية وضحاها في -20 درجة C.
- تدور في العينة 15000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثين دقيقة على 4 الى بيليه وعجلت ssDNA درجة مئوية. صب الحل باستخدام pipettor ثم إضافة 200 ميكرولتر من 70 ٪ إلى EtOH العينة لغسل NaOAc المتبقية وMgCl 2 من العينة. الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق في نفس السرعة ودرجة الحرارة لعينة إعادة بيليه.
- صب الحل EtOH باستخدام pipettor وإزالة آثار ما تبقى من الايثانول من خلال السماح لاحتضان أنبوب إيبندورف المفتوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. وبعد أن الايثانول الحالية في العينة تتداخل مع خطوة تضخيم PCR.
- Resuspend الكرية ssDNA (التي تحتوي على المنتج تيلوميراز ممدود والتمهيدي TCAS - TS) في 50 ميكرولتر من تفاعل PCR العازلة التي تحتوي على 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8) ، و 50 ملي بوكل ، 2 مم MgCl 2 ، 100 dNTPs ميكرومتر (dATP ، وdGTP dTTP) ، و 10 ميكرومتر [32 ف] dCTP ، 1 ميكرومتر TCAS CX - التمهيدي (5' - GTGTGACCTGACCTGACC - 3 ') و 1.25 U بوليميريز الحمض النووي طق.
- PCR تضخيم المنتجات استطالة تيلوميراز (29 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) ، بحيث تكون مرئية على هلام بولي أكريلاميد 12 ٪.
- قبل تشغيل هلام 12 ٪ مع تريس - البورات - EDTA (TBE) يعمل العازلة التي تحتوي على 44.5 ملي تريس ، 44.5 حمض البوريك ملي ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة (8) لمدة ثلاثين دقيقة قبل تشغيل عينات PCR. بعد مرحلة ما قبل التشغيل والتحميل الجل مع تفاعلات PCR ، تشغيل 185 فولت في هلام ل1،5-2 ساعات في 4 درجات مئوية أو على الجليد.
- الجافة واستخدام الجل لوحة التصوير الفوسفور لتصور النشاط.
7. ممثل النتائج :
ويرد مثال على TERT التكنيشيوم المنقى بعد استبعاد حجم اللوني في الشكل 2. يتم تشغيل هذا البروتين بعد تنقية تتركز على جل SDS - بولي أكريلاميد 12 ٪ ، وأظهرت أن أكثر من 99 ٪ النقي (الشكل 2A). وتقدم أيضا حجم الاستبعاد (S200) chromatogram (الشكل 2B) للتدليل على الطهارة وعدم وجود مجاميع من العينة البروتين النقي. وعادة ما يتم الحصول على محصول البروتين 5 ملغ بعد كل الخطوات لتنقية قد اكتملت على الرغم من أن العائد النهائي يمكن أن تختلف.
ومقايسة TRAP ممثل لتشكيل T. هو مبين في الشكل castaneum تيلوميراز 3 كما ذكرت من قبل ميتشل وآخرون 12. ويمكن رؤية سلم متدرج من المنتجات تيلوميراز في حارة 1 ، ومع ذلكفهي غائبة في كل تيلوميراز ريبونوكلياز في المعالجة ونشط TERT موقع عينات متحولة (D251A) في الممرات 2 و 3 على التوالي.
الشكل 1. الرسم البياني للخطوات المشاركة في إعادة تشكيل TERT التكنيشيوم المؤتلف. الأول ، هو المؤتلف التكنيشيوم TERT الإفراط في المعبر عنها في E. القولونية. ثم يتم تنقيته بواسطة بروتين النيكل وتبادل الأيونات الموجبة ، وحجم اللوني الاستبعاد. وT. يتم تربيتها في بيت castaneum الخنافس واليرقات تستخدم لعزل الحمض النووي الريبي الإجمالي. ثم يتم خلط التكنيشيوم المنقى TERT والحمض النووي الريبي لإعادة مجموع مجمع RNP تيلوميراز ، ويستخدم فحص TRAP لاحقة لتأكيد معقدة RNP هو تيلوميراز النشطة.
الشكل 2. حجم chromatogram الإقصاء وSDS PAGE تحليل للبروتين TERT TC. (A) 12 ٪ SDS - هلام بولي أكريلاميد من البروتين TERT التكنيشيوم اللوني بعد استبعاد الحجم. البروتين TERT TC (70 كيلو دالتون) يهاجر أسرع على جل SDS PAGE لأنه يحتوي على أعلى نقطة تساوي الكهربية (PI -- 9،8) (B) chromatogram الاستبعاد الحجم (Superdex S200) من البروتين TERT TC.
الشكل 3. أعيد المقايسات فخ خنفساء الدقيق في المختبر castaneum تيلوميراز مقتبس من ميتشل وآخرون 12. حارة 1 : اكتب التكنيشيوم TERT البرية والحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن يرقات الخنفساء. حارة 2 : اكتب التكنيشيوم TERT البرية وريبونوكلياز تعامل RNA مجموع اليرقات ومقتطفات الخلية. حارة 3 : نشط موقع متحولة التكنيشيوم TERT (D251A) والحمض النووي الريبي يرقات الخنفساء مجموع اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يسمح لإنتاج كميات كبيرة من الوحيدات الحفاز T. castaneum TERT تيلوميراز في الشكل ، وذوبان نشطة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. طريقة TERT التكنيشيوم الإفراط في التعبير هي حساسة لبعض التغييرات الطفيفة في درجات الحرارة أو الكثافة خلية من تلك المذكورة أعلاه ، ويمكن أن يؤثر بشكل كبير على مستويات بروتين تعبير. على وجه التحديد ، وجدنا أن يحفز الخلايا للبروتين تعبير أمام كثافة بصرية تصل إلى 0.5 في 600 نانومتر ، أو خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية قبل الاستقراء ، ويؤدي إلى انخفاض كبير في محصول البروتين.
من ناحية تنقية البروتين TERT التكنيشيوم لديه نقطة تساوي الكهربية الأساسية (PI -- 9،8) وهكذا يمكن استغلال قدرتها على ربط بإحكام على العمود الموجبة لتبادل لانتاج البروتين النقي عينة عن طريق تحميل وغسل العينة مع الملح التركيزات. إذا كانت الفائدة من البروتين لديها نقطة منخفضة تساوي الكهربية (PI <5) ويمكن تكييف هذا البروتوكول عن طريق استبدال الموجبة لتبادل لعمود أنيون الصرف ، وإعادة تحسين الظروف غسل لتحقيق نقاء أفضل البروتين.
في تجميع الانزيم ، وصفت الأسلوب هنا ليست سوى إعادة جزئية للعميم الإنزيم تيلوميراز لأنها لا تتضمن أي تيلوميراز البروتينات المرتبطة بها. على الرغم من أن هذه العناصر غير موجودة ، وأعيد تيلوميراز الذي يتألف من TERT التكنيشيوم المؤتلف والحمض النووي الريبي من مجموع T. castaneum اليرقات نشطا كما هو مبين في الشكل 3. قدرة فريدة لتيلوميراز إضافة يكرر متطابقة متعددة إلى نهايات الكروموسومات ، يمكن لعملية تعرف باسم Processivity إضافة كرر أن تصور من سلم من المنتجات في هلام الفخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
قدم هذا البحث هنا كان مدعوما من قبل وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا ، واليسون الطبية ، والخامس والأسس والزمرد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
