Summary
Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (
Abstract
Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) en de reconstructie van de actieve T. castaneum telomerase ribonucleoproteïne (RNP) complex in vitro.
Telomerase is een gespecialiseerde reverse transcriptase een die korte DNA-herhalingen, de zogenaamde telomeren, aan het 3 'einde van lineaire chromosomen 2 die dienen om hen te beschermen tegen end-to-end-fusion en degradatie toevoegt. Na DNA-replicatie, een kort segment verloren gaat aan het einde van het chromosoom 3 en zonder telomerase, blijven cellen te delen totdat uiteindelijk het bereiken van hun Hayflick Limit 4. Bovendien, telomerase inactief is in de meeste somatische cellen 5 bij volwassenen, maar is actief in kankercellen 6, waar het bevordert de cel onsterfelijkheid 7.
De minimale telomerase enzym bestaat uit twee kerncomponenten: het eiwit subunit (tert), die de katalytische subeenheid van het enzym en een integraal RNA-component (TER), waarin de sjabloon TERT gebruikt om te synthetiseren telomeren 8,9 omvat. Vóór 2008 had alleen de structuren voor de individuele telomerase domeinen opgelost 10,11. Een belangrijke doorbraak op dit gebied kwam van de bepaling van de kristalstructuur van de actieve 12, katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase, Tc TERT 1.
Hier presenteren we methoden voor het produceren van grote hoeveelheden van het actieve, oplosbare Tc TERT voor structurele en biochemische studies, en de reconstructie van de telomerase RNP complex in vitro telomerase activiteit assays. Een overzicht van de gebruikte experimentele methode is weergegeven in figuur 1.
Protocol
1. Expressie van recombinant Tc TERT
- Inoculeren 6 L van 2YT media (6 x 2 L Baffled erlenmeyers met een L van 2YT bouillon in elk) van zes verse platen van Rosetta getransformeerd (DE3) pLysS cellen met de synthetische Tc TERT plasmide met een TEV splitsbare N-terminale hexahistidine- tag.
- Grow-cellen bij 37 ° C onder schudden bij 220 rpm tot een OD 600 van 0,5-0,6.
- Induceren eiwitexpressie door de toevoeging van 1 mM IPTG.
- Verminder de temperatuur tot 30 ° C, langzaam schudden tot 150 rpm, en laat cellen om eiwitten voor 4-5 uur te drukken
- Oogst cellen door centrifugeren bij 4 ° C en 3500 rpm gedurende 30 minuten.
- Resuspendeer elk een L celpellet in 20 ml buffer die 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 0,5 M KCl, 15 mM imidazool, 5 mM β-mercapto-ethanol, en 0,1 mM fenylmethyl sulphonyl fluoride (PMSF) en benzamidine.
- Flash bevriezen geresuspendeerd cel mengsel door het langzaam druppelen de cellen in een 50 ml plastic conische buis gevuld met vloeibare stikstof, zodat elke druppel bevriest bij impact in de vloeistof N 2. Bewaar bevroren cellen bij -80 ° C tot aan eiwitzuivering.
2. Zuivering van Tc TERT
- Dooi-cellen bij kamertemperatuur tot een vloeibare consistentie is bereikt en vervolgens op metalen bekers bewegen op ijs ultrasoonapparaat.
- Ultrasone trillingen cellen op ijs gedurende 2 minuten in 30 seconden met 30 seconden pauze, ongeveer 51 W vermogen.
- Spin down gelyseerde cellen bij 18.000 rpm gedurende 20 min aan de oplosbare en onoplosbare proteïne fracties gescheiden en verwijder voorzichtig het supernatant voor de Nickel affiniteitschromatografie.
- Evenwicht van de Ni-NTA (nikkel-nitrilotriazijnzuur) kolom met buffer die 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 0,5 M KCl, 15 mM imidazool, 5 mM β-mercapto-ethanol, en 0,1 mM PMSF en benzamidine.
- Laad supernatant over de hars en het verzamelen van de doorstroming.
- Was de kolom met buffer die 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mM KCl, 15 mM imidazool, 5 mM β-mercapto-ethanol, en 0,1 mM PMSF alle overblijvende en niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.
- Elueer Tc TERT van de Ni-NTA-hars met behulp van een imidazool-gradiënt van 15 - 300 mm en het verzamelen van 3 ml fracties voor SDS-PAGE-analyse.
- Gebruik PAGE-analyse om te bepalen welke fracties bevatten Tc TERT eiwit en deze fracties zich concentreren in een Amicon 30 kDa (Millipore) filter.
- Concentreer Tc TERT fracties tot een volume van minder dan 10 ml voor verdere zuivering.
- De Tc TERT wordt verder gezuiverd over de kationenwisselingskolom (HS poros, Applied Biosystems) pre-geëquilibreerd met buffer die 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mM KCl, en 1 mM DTT.
- Laad het eiwit mix op de HS poros kolom lopen en was het aan alle eiwit en nucleïnezuur verontreinigingen te verwijderen.
- Was de kolom met buffer die 500 mM KCl, gevolgd door 700 mM KCl om de resterende verontreinigingen te verwijderen.
- Elueer de Tc TERT eiwit uit de HS poros kolom met 1 M KCl buffer. Op dit punt van het eiwit moet meer zijn dan 99% zuiver.
- Verwijder eventuele eiwit aggregaten door het passeren van het eiwit in een Superdex-200 sizing kolom (size exclusion chromatografie - GE Healthcare), pre-geëquilibreerd met buffer die 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mM KCl, en 1 mM TCEP.
3. Tribolium castaneum kever cultuur
- De T. castaneum kevers, waar in eerste instantie bedoeld als een geschenk door dr. S. Brown, afdeling Biologie, Kansas State University.
- Start T. castaneum cultuur door het toevoegen van honderd volwassen kevers om een container met 28,5 g bloem en 1,5 g gedroogde gist bakker.
- Bewaar kever culturen bij kamertemperatuur en in een donkere, vochtige omgeving voor drie tot vier weken toe te staan voor de voortplanting en groei. Plaats een bekerglas met water in de kever opslagruimte aan een vochtige omgeving te verzekeren.
- Oogst de keverlarven als nodig is voor RNA isolatie. Laat de resterende larven volwassen genoeg is om volwassenen, waardoor ze in dezelfde cultuur.
- Elke maand, overdracht van de meest actieve kevers (niet meer dan honderd), in een nieuwe kolf met verse meel en gist om hun voedselvoorziening te vullen.
4. T. castaneum Totaal RNA isolatie
- Oogst 20 keverlarven van de cultuur (elke cultuur moet bevatten tussen de 500-1000 larven), door ze te scheiden van de volwassen kevers en de bloem / gist cultuur. Elimineer bloem of gist deeltjes aan de kevers vóór het wordt vermalen hen.
- Steriliseer de bank gebied, de mortel, en de stamper (denk aan het behandelen van de handschoenen ook) gebruikt voor deze procedure met RNaseZap (Ambion, Inc) om alle sporen van ribonucleasen te verwijderen alvorens het slijpen van de kevers.
- Grind larven in vloeibare N 2 in een fijn poeder met behulp van een mortier en een stamper en transfer het poeder om een centrifugebuis van 50 ml met behoud van de vloeibare N 2 om ervoor te zorgen dat het poeder blijft bevroren totdat de extractie buffer wordt toegevoegd.
- Laat overtollige vloeistof N 2 te verdampen van het poeder. Nadat de vloeistof N 2 is verdampt, homogeniseren de kever poeder in 200 ul extractiebuffer (per 20 keverlarven) die 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercapto-ethanol, 1 mM EGTA, 0,1 mM benzamidine, 200 mM KCl, 10 % glycerol, 10 mM imidazool en de 20U van RNasin, pH 7,5 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de homogenaat bij 15.000 rpm gedurende 20 minuten bij 4 ° C, het verzamelen van de supernatant en flits bevriezen van het monster in vloeibare N 2. Indien nodig, kunnen monsters worden bewaard bij -80 ° C gedurende de nacht.
- Pak het totaal RNA met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen).
5. In vitro reconstitutie van Tribolium castaneum telomerase
- Mix 20 ng recombinant His-gelabeld Tc TERT met 50 ul van T. castaneum totaal RNA in de bindende buffer die 25 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 10% glycerol, 5 mM β-mercapto-ethanol, en 10 mM imidazool, pH 7,5.
- Incubeer de Tc TERT - totaal RNA mengsel gedurende twee uur bij 22 ° C in T. castaneum lysaat in de aanwezigheid van RNasin inhibitor om RNA-degradatie te voorkomen.
- Zuiveren het complex over een Ni-NTA kolom lysaat onzuiverheden en overtollige RNA te verwijderen.
6. Telomerase herhalen versterking protocol (TRAP) assays
- Mix 4 ug van Ni-NTA gezuiverd T. castaneum telomerase in 50 ul rek-buffer die 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 mM MgCl2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EGTA, 0,01% BSA, 0,5 mM dNTPs, 1 uM TCAS-TS DNA-primer (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), en incubeer het mengsel bij 30 ° C gedurende 60 minuten tot verlenging van de TCA-TS DNA primer mogelijk te maken door het gereconstitueerde T. castaneum telomerase.
- Extract van de langgerekte enkelstrengs DNA (ssDNA), door het toevoegen van een gelijk volume fenol chloroform aan het reactiemengsel. Schud het mengsel zachtjes totdat de emulsie homogeen is.
- Centrifugeer het monster bij 12.000 rpm gedurende vijf minuten bij 4 ° C om de ssDNA scheiden van verontreinigingen.
- Breng de bovenste waterlaag van het monster naar een 1,5 ml Eppendorf buis, voeg een uiteindelijke concentratie van 10 mM NaOAc (pH 5,0), 1 mM MgCl2, en 66,4% EtOH en laat het monster op neerslag 's nachts bij -20 ° C.
- Spin het monster bij 15.000 rpm gedurende dertig minuten bij 4 ° C om pellet de neergeslagen ssDNA. Schenk de oplossing met een pipet en voeg 200 ul van 70% EtOH om het monster om de resterende NaOAc en MgCl 2 wassen uit het monster. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij dezelfde snelheid en temperatuur opnieuw pellet het monster.
- Schenk de EtOH-oplossing met behulp van een pipet en verwijder de resterende sporen van ethanol, doordat de eppendorfbuisje te openen incuberen bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Na ethanol aanwezig in het monster zal interfereren met de PCR-amplificatie stap.
- Resuspendeer de ssDNA pellet (met het telomerase langgerekte product en het TCAS-TS primer) in 50 pi PCR-reactie-buffer die 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 100 pM dNTPs (dATP, dGTP en dTTP), 10 uM [32 P] dCTP, 1 uM TCAS-CX primer (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') en 1,25 U Taq DNA-polymerase.
- PCR versterken de telomerase rek producten (29 cycli van 94 ° C gedurende 30 seconden, 50 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut), zodat ze zichtbaar zijn op een 12% polyacrylamide gel.
- Pre-run van de 12% gel met Tris-Boraat-EDTA (TBE) loopt buffer met 44,5 mM Tris, 44,5 mM boorzuur, 1 mM EDTA, pH 8 gedurende dertig minuten voor het uitvoeren van de PCR-monsters. Na de pre-running en het laden van de gel met de PCR-reacties, voert u de gel bij 185 Volt voor 1,5-2 uur bij 4 ° Celsius of op ijs.
- Droog de gel en gebruik de fosfor imaging plaat om de activiteit te visualiseren.
7. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van het gezuiverde Tc TERT na size exclusion chromatografie is weergegeven in figuur 2. Het eiwit geconcentreerde na zuivering wordt uitgevoerd op een 12% SDS-polyacrylamide gel en is aangetoond dat meer dan 99% zuiver (figuur 2A) zijn. De grootte uitsluiting (S200) chromatogram is ook voorzien (Figuur 2B) om de zuiverheid en het ontbreken van aggregaten uit het gezuiverde eiwit sample aan te tonen. Een rendement van 5 mg eiwit nadat alle zuivering stappen zijn voltooid wordt meestal verkregen, hoewel de uiteindelijke opbrengst kan variëren.
Een vertegenwoordiger TRAP test voor de gereconstitueerde T. castaneum telomerase is weergegeven in figuur 3, zoals eerder gerapporteerd door Mitchell et al.. 12. De stapsgewijze ladder van telomerase-producten zijn te zien in baan 1, maarze zijn afwezig in zowel het RNase behandeld telomerase en de TERT actieve site mutant (D251A) monsters in de lanen 2 en 3 respectievelijk.
Figuur 1. Stroomschema van de stappen die betrokken zijn bij de reconstructie van het recombinante Tc TERT. Eerst wordt de recombinant Tc TERT over-expressie gebracht in E. coli. Het eiwit wordt dan gezuiverd door nikkel, kationenuitwisseling, en de size exclusion chromatografie. De T. castaneum kevers worden gekweekt in huis en hun larven worden gebruikt om de totale RNA te isoleren. De gezuiverde Tc TERT en de totale RNA worden vervolgens gemengd te reconstrueren de telomerase RNP complex, en een volgende TRAP-assay wordt gebruikt om de RNP complex te bevestigen is een actief telomerase.
Figuur 2. Grootte uitsluiting chromatogram en SDS PAGE-analyse van Tc TERT eiwit. (A) 12% SDS-polyacrylamide gel van de Tc TERT eiwit na de size exclusion chromatografie. De Tc TERT eiwit (70 kDa) migreert sneller op de SDS-PAGE-gel, omdat het heeft een hoog iso-elektrisch punt (pI - 9,8). (B) Maat uitsluiting chromatogram (Superdex S200) van de Tc TERT eiwit.
Figuur 3. TRAP testen van de in vitro gereconstitueerde Tribolium castaneum telomerase aangepast van Mitchell et al.. 12. Laan 1: wild-type Tc TERT en totaal RNA geïsoleerd van keverlarven. Laan 2: wild-type Tc TERT en RNase behandeld larven totaal RNA en cel-extracten. Baan 3: actieve site mutant Tc TERT (D251A) en keverlarven totaal larven RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode zorgt voor de productie van grote hoeveelheden van de katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase TERT in oplosbare, actieve vorm van structurele en biochemische studies. De methode van Tc TERT over-expressie is gevoelig voor subtiele veranderingen in temperatuur of celdichtheid van de hierboven vermeld en kan drastisch invloed hebben op de niveaus van eiwitexpressie. In het bijzonder, hebben we gevonden dat het induceren van de cellen voor proteïne-expressie voor de optische dichtheid bereikt 0,5 bij 600 nm, of het verlagen van de temperatuur tot 30 ° C voor inductie, leidt tot een aanzienlijke vermindering in het eiwit opbrengst.
In termen van de zuivering, de Tc TERT eiwit heeft een basis iso-elektrisch punt (pI - 9,8) en dus het vermogen om stevig te binden aan de kationenwisselingskolom kan worden benut om een pure eiwitmonster opbrengst door het laden en het wassen van het monster met een hoog zoutgehalte concentraties. Als een eiwit van belang waren om een lage iso-elektrisch punt hebben (PI <5) dit protocol kan worden aangepast door het vervangen van de kation-uitwisseling voor een anion-uitwisseling kolom, en opnieuw was het optimaliseren van de voorwaarden om de beste eiwit zuiverheid te bereiken.
Bij de samenstelling van het enzym, de hier beschreven methode is slechts een gedeeltelijke reconstructie van het telomerase holoenzyme omdat het bevat geen telomerase geassocieerde eiwitten. Hoewel deze componenten niet aanwezig zijn, de gereconstitueerde telomerase, bestaande uit de recombinant Tc TERT en totaal RNA van T. castaneum larven is actief als weergegeven in figuur 3. De unieke mogelijkheid voor telomerase om meerdere identieke herhalingen toe te voegen aan de uiteinden van chromosomen, kan een proces dat bekend staat als Herhaal de toevoeging Processivity, worden gevisualiseerd door de ladder van producten in de TRAP-gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het onderzoek dat hier werd ondersteund door de Pennsylvania Department of Health, The Ellison Medical, De V en The Emerald stichtingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
