Summary
המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (
Abstract
המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (Tc טרט) ואת הכינון מחדש של ט פעיל ribonucleoprotein castaneum telomerase (RNP) מורכב במבחנה.
Telomerase הוא transcriptase הפוכה התמחה 1 המוסיפה חוזר דנ"א קצרים, נקרא הטלומרים, עד הסוף '3 של כרומוזומים ליניארית 2 המשמשים כדי להגן עליהם מפני היתוך end-to-end והשפלה. בעקבות שכפול הדנ"א, קטע קצר הוא איבד בסוף כרומוזום 3 וללא telomerase, התאים ממשיכים להתחלק עד שבסופו של דבר להגיע הגבלת Hayflick שלהם 4. בנוסף, telomerase הוא רדום ברוב התאים הסומטיים 5 אצל מבוגרים, אך היא פעילה 6 תאים סרטניים בהם הוא מקדם את אלמוות תא 7.
האנזים telomerase מינימלי מורכבת משני רכיבי הליבה: למקטע החלבון (טרט), אשר כוללת את למקטע הקטליטי של האנזים ואת מרכיב בלתי נפרד RNA (TER), אשר מכיל את תבנית משתמש טרט לסנתז הטלומרים 8,9. לפני 2008, רק מבנים בודדים לתחומים telomerase נפתרו 10,11. פריצת דרך משמעותית בתחום זה בא קביעת המבנה הגבישי של 12 הפעיל, למקטע הקטליטית של ט ' telomerase castaneum, Tc טרט 1.
כאן, אנו מציגים שיטות להפקת כמויות גדולות של טרט פעיל, Tc מסיסים ללימודי מבניים ביוכימיים, ואת הכינון מחדש של המתחם telomerase RNP במבחנה עבור מבחני פעילות הטלומרז. סקירה של שיטות ניסיוניות בשימוש מוצג באיור 1.
Protocol
1. ביטוי רקומביננטי טרט Tc
- לחסן 6 L של 2YT התקשורת (6 x 2 L נבוך צלוחיות Erlenmeyer המכיל 1 ליטר של מרק 2YT בכל אחד) מתוך שש צלחות טריים של תאים pLysS הפך רוזטה (DE3) המכיל את סינתטיים Tc טרט פלסמיד עם TeV N-מסוף cleavable hexahistidine- תג.
- התאים לגדול ב 37 ° C תוך רועד בסל"ד 220 עד 600 OD של 0.5-0.6.
- להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ"מ.
- הפחת את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, איטי רועד עד 150 סל"ד, ולאפשר לתאים לבטא חלבון 4-5 ח
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C ו - 3500 סל"ד למשך 30 דקות.
- Resuspend כל 1 תא L גלולה ב 20 מ"ל של המאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ 'KCl, 15 מ"מ Imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 sulphonyl phenylmethyl mM פלואוריד (PMSF) ו benzamidine.
- פלאש להקפיא resuspended תערובת תאים על ידי לאט מטפטף את התאים לתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי פלסטיק מלא חנקן נוזלי, כך כל טיפה קופאת על ההשפעה של נוזלי N 2. חנות תאים קפואים ב -80 ° C עד מוכנים לטיהור חלבונים.
2. טיהור Tc טרט
- תאים להפשיר בטמפרטורת החדר עד למרקם נוזלי הוא הגיע ולאחר מכן לעבור כוסות מתכת על קרח sonication.
- Sonicate תאים על קרח דק 2 ב 30 מרווחי השני עם 30 second הפסקות, על כ 51 וואט.
- ספין למטה תאים lysed בסל"ד 18,000 עבור 20 דקות להפריד את החלבון שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ובזהירות להסיר את supernatant עבור כרומטוגרפיה זיקה ניקל.
- לאזן Ni-נ.ת. ע (ניקל nitrilotriacetic חומצה) טור עם מאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ 'KCl, 15 מ"מ imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ"מ PMSF ו benzamidine.
- טען supernatant על שרף לאסוף את הזרימה דרך.
- לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ"מ KCl, 15 מ"מ imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ"מ PMSF כדי להסיר את כל החלבונים מחויב שיורית ולא באופן ספציפי.
- Elute Tc טרט של שרף Ni-נ.ת. ע באמצעות שיפוע imidazole של 15-300 מ"מ לאסוף 3 שברים מ"ל לניתוח SDS PAGE.
- השתמש בדף 'ניתוח כדי לקבוע אילו שברים מכילים חלבון Tc טרט ולהתרכז אלה שברים ב Amicon 30 kDa (Millipore) לסנן.
- תתרכז Tc שברים טרט לנפח פחות מ -10 מ"ל לטיהור נוסף.
- טרט Tc מטוהרים נוסף על עמודה קטיון מטבע (HS פורוס, Applied Biosystems) מראש equilibrated עם חוצץ המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 KCl mM, ו 1 DTT מ"מ.
- טען את תערובת החלבונים על העמודה HS פורוס לשטוף אותה להסיר את כל חלבון ומזהמים חומצות גרעין.
- לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 500 KCl mM ואחריו mM 700 KCl להסיר כל המזהמים שנותרו.
- Elute החלבון טרט Tc את הטור HS פורוס עם חיץ 1 KCl ז. בשלב זה החלבון צריך להיות יותר מ 99% טהור.
- הסר את כל אגרגטים חלבון על ידי העברת חלבון על עמודה אומדת Superdex-200 (הרחקה גודל כרומטוגרפיה - GE Healthcare), טרום equilibrated עם מאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ"מ KCl, ו 1 TCEP מ"מ.
3. Tribolium castaneum תרבות חיפושית
- ט castaneum חיפושיות שבה סיפקה בתחילה כמתנה על ידי ד"ר ס 'בראון, חטיבה של ביולוגיה, קנזס סטייט.
- התחל ט castaneum התרבות על ידי הוספת 100 חיפושיות בוגרות מכולה עם 28.5 גר 'קמח 1.5 גרם של שמרים יבשים של האופה.
- חנות תרבויות חיפושית בטמפרטורת החדר בסביבה, חשוך ולח במשך שלושה עד ארבעה שבועות, כדי לאפשר רבייה וגדילה. מניחים כוס המכילה מים באזור אחסון חיפושית כדי להבטיח סביבה לחה.
- קציר הזחלים חיפושית כנדרש עבור בידוד RNA. אפשר הזחלים הנותרים להבשיל למבוגרים, לשמור אותם באותה תרבות.
- בכל חודש, להעביר את חיפושיות הפעילים ביותר (לא יותר ממאה) לתוך בקבוק חדש המכיל קמח שמרים טריים לחדש אספקת המזון שלהם.
4. ט castaneum סך RNA בידוד
- 20 קציר חיפושית הזחלים מן התרבות (כל תרבות צריכה להכיל בין הזחלים 5-100) על ידי הפרדתם חיפושיות מבוגר ותרבות קמח / שמרים. סלקו קמח או חלקיקים שמרים המחוברים חיפושיות לפני שחיקה אותם.
- לחטא את אזור הספסל, המלט, ואת העלי (לשקול טיפול בכפפות גם) המשמש בהליך זה עם RNaseZap (Ambion, Inc) כדי להסיר את כל עקבות של ribonucleases לפני שחיקה החיפושיות.
- טוחנים הזחלים בנוזל N 2 לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי ו transfer את האבקה אל צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, תוך שמירה על נוזלי N 2 על מנת להבטיח כי האבקה נשאר קפוא עד החיץ החילוץ הוא הוסיף.
- אפשר נוזל עודף N 2 להתאדות מן האבקה. לאחר N נוזלי 2 התאדו, homogenize את אבקת חיפושית ב 200 μl של חיץ החילוץ (לכל הזחלים 20 חיפושית) המכיל 25 מ"מ טריס-HCl, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, 1 mM EGTA, benzamidine 0.1 מ"מ, 200 מ"מ KCl, 10 גליצרול%, 10 mM imidazole ו 20U של RNasin, pH 7.5 ו לדגור על קרח במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה homogenate 15,000 סל"ד במשך 20 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant ופלאש להקפיא את מדגם N נוזלי 2. במידת הצורך, ניתן לאחסן דגימות ב -80 ° C במשך הלילה.
- חלץ את סך RNA באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen).
5. הכינון מחדש במבחנה של telomerase castaneum Tribolium
- מערבבים 20 מיקרוגרם של רקומביננטי שלו מתויג Tc טרט עם 50 μl של ט ' castaneum RNA סך למאגר מחייב המכיל 25 מ"מ טריס-HCl, 200 מ"מ KCl, גליצרול 10%, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, 10 mM imidazole, pH 7.5.
- דגירה טרט Tc - סך הכל תערובת RNA במשך שעתיים על 22 מעלות צלזיוס ט castaneum lysate בנוכחות מעכב RNasin כדי למנוע השפלה RNA.
- לטהר את מורכבות על עמודה Ni-נ.ת. ע כדי להסיר זיהומים lysate ו-RNA עודף.
6. לחזור telomerase הגברה פרוטוקול (מלכודת) מבחני
- מערבבים 4 מיקרוגרם של Ni-נ.ת. ע מטוהרים ט telomerase castaneum במאגר התארכות 50 μl המכיל 20 מ"מ טריס-HCl (pH - 8.3), 7.5 mM MgCl 2, 63 mM KCl, 0.05% Tween 20, 1 mM EGTA, BSA 0.01%, 0.5 dNTPs מ"מ, 1 מיקרומטר TCAs-TS דנ"א פריימר (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 "), ואת דגירה את התערובת על 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לאפשר התארכות של פריימר TCAs-TS את ה-DNA על ידי T. מחדש castaneum telomerase.
- חלץ את ה-DNA מוארכת חד גדילי (ssDNA) על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם לתערובת התגובה. לנער את התערובת בעדינות עד אמולסיה היא הומוגנית.
- צנטריפוגה מדגם בסל"ד 12,000 למשך חמש דקות בשעה 4 ° C כדי להפריד את ssDNA של מזהמים.
- מעבירים את השכבה המימית העליון של המדגם כדי צינור 1.5 Eppendorf מ"ל; להוסיף הריכוז הסופי של 10 mM NaOAc (pH 5.0), 1 מ"מ MgCl 2, ו - 66.4% EtOH ולאחר מכן לאפשר את המדגם כדי לזרז לילה ב -20 ° ג
- ספין המדגם בסל"ד 15,000 במשך שלושים דקות 4 ° C עד גלולה ssDNA זירז. למזוג את הפתרון באמצעות pipettor ולאחר מכן להוסיף 200 μl של EtOH 70% המדגם לשטוף NaOAc הנותרים MgCl 2 מן המדגם. צנטריפוגה מדגם במשך חמש דקות במהירות את הטמפרטורה באותו המדגם מחדש גלולה.
- למזוג את הפתרון EtOH באמצעות pipettor ולהסיר שאריות של אתנול בכך שהוא מאפשר את הצינור Eppendorf כדי לדגור לפתוח בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר בהווה אתנול במדגם יפריע לשלב הגברה PCR.
- Resuspend גלולה ssDNA (המכיל את המוצר telomerase מאורכים תחל TCAs-TS) ב 50 μl של חיץ תגובת PCR המכיל 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl 2, 100 dNTPs מיקרומטר (dATP, dGTP ו dTTP), 10 מיקרומטר [32 טז] dCTP, 1 TCAs-CX מיקרומטר פריימר (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ") ו - 1.25 U-DNA פולימראז תקי.
- PCR להגביר את התארכות telomerase המוצרים (29 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, ו - 72 ° C עבור 1 דקה), כך שהם נראים על ג'ל polyacrylamide 12%.
- טרום להפעיל את הג'ל עם 12% טריס-borate-EDTA (TBE) מפעיל מאגר המכיל 44.5 mM טריס, חומצה 44.5 mM בור, 1 mM EDTA, pH 8 במשך שלושים דקות לפני ריצה את דגימות ה-PCR. לאחר שלפני ריצה טעינת ג'ל עם התגובות PCR, הפעל את הג'ל על 185 וולט עבור 1.5-2 שעות 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
- יבש את הג'ל ולהשתמש צלחת הדמיה זרחן לדמיין פעילות.
7. נציג תוצאות:
דוגמה של Tc מטוהרים כרומטוגרפיה טרט לאחר הרחקה גודל מוצג באיור 2. חלבון מרוכז לאחר טיהור מנוהלת על ג'ל SDS-polyacrylamide 12% ו מוצגת להיות יותר מ 99% טהור (איור 2 א). הדרה גודל (S200) chromatogram הוא גם סיפק (תרשים 2B) כדי להדגים את חוסר הטוהר של אגרגטים מן המדגם חלבון מטוהרים. תשואה של 5 מ"ג חלבון אחרי כל השלבים לטיהור הושלמו מתקבל בדרך כלל על אף התשואה הסופית יכולה להשתנות.
מלכודת נציג assay עבור ט מחדש telomerase castaneum מוצג באיור 3 כפי שדווח קודם לכן על ידי מיטשל et al. 12. הסולם צעד נבון של מוצרים telomerase ניתן לראות במסלול 1, אולםהם נעדרים telomerase הן RNase מטופלים הפעיל טרט אתר מוטנט (D251A) דגימות מסלולים 2 ו -3 בהתאמה.
באיור 1. תרשים זרימה של שלבי הכינון מחדש של רקומביננטי Tc טרט. ראשית, רקומביננטי Tc טרט היא ביטוי יתר של E. coli. חלבון הוא מטוהרים מכן על ידי ניקל, חילופי קטיונים, והדרה כרומטוגרפיה גודל. ט חיפושיות castaneum הם מתורבת בבית וזחלים שלהם משמשים כדי לבודד את הרנ"א מוחלט. Tc מטוהרים טרט ואת RNA סך מעורבבים ואז לחדש את מורכבות RNP telomerase, וכן assay המלכודת הבאים משמש כדי לאשר את מורכבות RNP הוא telomerase פעיל.
איור 2. הדרה גודל chromatogram וניתוח SDS PAGE של חלבון טרט Tc. (א) 12% SDS-polyacrylamide ג'ל של החלבון Tc טרט לאחר כרומטוגרפיה הדרה גודל. החלבון טרט Tc (70 KDA) נודד מהר יותר על ג'ל SDS PAGE כי יש לו נקודה isoelectric גבוהה (PI - 9.8). (ב) הרחקה גודל chromatogram (Superdex S200) של החלבון Tc טרט.
איור 3. מבחני המלכודת של במבחנה מחדש telomerase Tribolium castaneum עיבוד מיטשל et al. 12. ליין 1: בר סוג Tc טרט ו-RNA שבודד סך זחלי החיפושית. ליין 2: בר סוג Tc טרט ו RNase טיפול הכולל זחלים RNA ותמציות התא. ליין 3: פעיל באתר מוטציה Tc טרט (D251A) וסך זחלי החיפושית RNA הזחלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מאפשרת ייצור של כמויות גדולות של למקטע הקטליטית של ט ' castaneum טרט telomerase בצורת, מסיסים פעיל ללימודי מבניים ביוכימיים. השיטה של Tc טרט יתר ביטוי רגיש שינויים עדינים בטמפרטורה או צפיפות התאים מאלה כאמור לעיל יכול להשפיע באופן דרמטי את רמות ביטוי חלבון. באופן ספציפי, מצאנו כי גרימת התאים על ביטוי החלבון לפני צפיפות אופטית מגיעה 0.5 ב 600 ננומטר, או להנמיך את הטמפרטורה ל 30 מעלות צלזיוס לפני הגיוס, מוביל לירידה משמעותית בתשואה חלבון.
במונחים של טיהור, החלבון טרט Tc יש נקודת isoelectric בסיסיים (PI - 9.8) ולכן יכולתו להיקשר בחוזקה טור קטיון-חילופי ניתן לנצל להניב מדגם חלבון טהור על ידי העמסה כביסה מדגם במלח גבוה ריכוזי. אם חלבון עניין היו לי נקודת isoelectric נמוכה (PI <5) פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על ידי החלפת קטיון-בתמורה טור אניון-חילופי, מחדש אופטימיזציה התנאים לשטוף כדי להשיג את טוהר החלבון הטוב ביותר.
בהרכבת האנזים, השיטה המתוארת כאן היא רק ושיחזור חלקי של holoenzyme telomerase משום שהיא אינה כוללת כל חלבונים הקשורים telomerase. אמנם רכיבים אלה אינם נוכחים, telomerase מחדש בהיקף של רקומביננטי Tc טרט וסך RNA מ ט הזחלים castaneum פעיל כפי שמוצג באיור 3. יכולת ייחודית telomerase להוסיף חוזרת זהים מרובים קצות הכרומוזומים, תהליך המכונה Processivity תוספת חזור, ניתן דמיינו ידי הסולם של מוצרי הג'ל מלכודת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי משרד הבריאות של פנסילבניה, רפואי אליסון, V ו יסודות אמרלד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
