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Biology

सक्रिय टी. के पुनर्गठन इन विट्रो में castaneum टेलोमिरेज

Published: July 14, 2011 doi: 10.3791/2799
Automatic Translation
1, 1, 1
1Gene Expression and Regulation, The Wistar Institute, University of Pennsylvania

Summary

टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert के अलगाव के लिए तरीकों वर्तमान (

Abstract

टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert (टीसी tert) के अलगाव और सक्रिय टी. के पुनर्गठन के लिए तरीकों वर्तमान castaneum इन विट्रो में टेलोमिरेज ribonucleoprotein जटिल (RNP).

टेलोमिरेज एक विशेष रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक है कि कम डीएनए दोहराता है, रैखिक गुणसूत्रों 2 कि उन्हें समाप्त करने के लिए अंत संलयन और गिरावट से बचाने की सेवा के 3 'अंत करने के लिए telomeres कहा जाता है, कहते हैं. डीएनए प्रतिकृति के बाद, एक छोटी खंड 3 गुणसूत्र के अंत में और टेलोमिरेज के बिना खो दिया है, कोशिकाओं को अंततः उनके Hayflick सीमा 4 तक पहुँचने तक विभाजित जारी रखने के. इसके अतिरिक्त, टेलोमिरेज ज्यादातर वयस्कों में दैहिक 5 कोशिकाओं में निष्क्रिय है, लेकिन कैंसर कोशिकाओं 6 जहां यह सेल अमरता 7 को बढ़ावा देता है में सक्रिय है .

प्रोटीन (tert) सबयूनिट, जो एंजाइम उत्प्रेरक सबयूनिट और एक अभिन्न शाही सेना (TER) घटक है, जो शामिल हैं टेम्पलेट tert 8,9 telomeres के synthesize करने के लिए उपयोग करता है शामिल हैं: न्यूनतम टेलोमिरेज एंजाइम दो मुख्य घटकों के होते हैं. 2008 से पहले, व्यक्तिगत टेलोमिरेज डोमेन के लिए संरचनाओं केवल 10,11 हल किया गया था. इस क्षेत्र में एक बड़ी सफलता सक्रिय 12 की क्रिस्टल संरचना का निर्धारण, टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट से आया castaneum टेलोमिरेज, टीसी 1 tert.

यहाँ, हम संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय, घुलनशील टीसी tert, और टेलोमिरेज गतिविधि assays के लिए टेलोमिरेज इन विट्रो में RNP जटिल के पुनर्गठन की एक बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. प्रायोगिक तरीकों का इस्तेमाल किया के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.

Protocol

1. पुनः संयोजक टीसी tert की अभिव्यक्ति

  1. Rosetta तब्दील (DE3) pLysS TEV cleavable एन टर्मिनल के साथ सिंथेटिक टीसी tert प्लाज्मिड युक्त कोशिकाओं के छह ताजा प्लेटों से 2YT मीडिया के 6 एल (6 x 2 एल प्रत्येक में 2YT शोरबा 1 एल युक्त Erlenmeyer बोतल baffled) टीका लगाना hexahistidine - टैग.
  2. 37 में कोशिकाओं को विकसित डिग्री सेल्सियस जबकि 0.5-0.6 के 220 एक 600 आयुध डिपो के लिए rpm पर मिलाते हुए.
  3. 1 मिमी IPTG जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित.
  4. 30 के लिए तापमान कम ° सी, rpm 150 मिलाते धीमी है, और कोशिकाओं को 4-5 एच. के लिए प्रोटीन व्यक्त करने की अनुमति
  5. Centrifugation द्वारा 4 कोशिकाओं हार्वेस्ट डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 3500 rpm.
  6. 25 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10% ग्लिसरॉल, 0.5 एम KCl, 15 मिमी imidazole, 5 मिमी β-mercaptoethanol, और 0.1 मिमी phenylmethyl sulphonyl (PMSF) फ्लोराइड और benzamidine वाले बफर के 20 मिलीलीटर में प्रत्येक 1 एल सेल गोली Resuspend.
  7. फ्लैश फ्रीज धीरे धीरे एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार तरल नाइट्रोजन के साथ भरा ताकि प्रत्येक बूंद तरल एन 2 में प्रभाव पर जमा देता ट्यूब में कोशिकाओं टपकाव द्वारा सेल मिश्रण resuspended. -80 में जमे हुए कोशिकाओं स्टोर डिग्री सेल्सियस तक प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए तैयार है.

2. टीसी tert के शोधन

  1. कमरे के तापमान पर एक तरल निरंतरता तक पिघलना कोशिकाओं तक पहुँच जाता है और फिर sonication के लिए बर्फ पर धातु beakers के लिए कदम.
  2. 30 सेकंड के अंतराल में 30 सेकंड बिजली की लगभग 51 डब्ल्यू पर pauses, के साथ बर्फ पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं Sonicate.
  3. नीचे 20 मिनट के लिए 18,000 rpm पर lysed कोशिकाओं को स्पिन करने के लिए अलग घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन भिन्न और ध्यान से निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  4. नी NTA (एसिड निकल nitrilotriacetic) बफर के साथ 25 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10% ग्लिसरॉल, 0.5 एम KCl, 15 मिमी imidazole, 5 मिमी β-mercaptoethanol, और 0.1 मिमी PMSF और benzamidine युक्त स्तंभ संतुलित.
  5. राल पर सतह पर तैरनेवाला लोड और प्रवाह के माध्यम से एकत्र.
  6. बफर के साथ 25 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10% ग्लिसरॉल, 500 मिमी KCl, 15 मिमी imidazole, 5 मिमी β-mercaptoethanol, और 0.1 मिमी PMSF युक्त सभी अवशिष्ट और गैर - विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन हटाने स्तंभ धो लें.
  7. नी NTA 15 के एक imidazole ढाल का उपयोग राल की Elute टीसी tert - 300 मिमी और एसडीएस PAGE विश्लेषण के लिए 3 मिलीलीटर भिन्न इकट्ठा.
  8. PAGE विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए जो भिन्न टीसी tert प्रोटीन होते हैं और एक Amicon 30 (Millipore) केडीए फिल्टर में इन भिन्न ध्यान केंद्रित .
  9. एक आगे की शुद्धि के लिए कम से कम 10 मिलीलीटर मात्रा टीसी tert भिन्न ध्यान लगाओ .
  10. टीसी tert आगे कटियन विनिमय (एचएस poros, एप्लाइड Biosystems) स्तंभ बफर के साथ 25 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10% ग्लिसरॉल, 500 मिमी KCl, और 1 मिमी डीटीटी युक्त पूर्व equilibrated पर शुद्ध है.
  11. एच एस poros स्तंभ पर प्रोटीन मिश्रण लोड और इसे धोने के लिए सभी प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड contaminants को हटाने.
  12. बफर के साथ 500 मिमी 700 मिमी के लिए किसी भी शेष contaminants के हटायें KCl द्वारा पीछा KCl युक्त स्तंभ धो लें.
  13. 1 एम KCl बफर के साथ एच एस poros स्तंभ बंद टीसी tert प्रोटीन Elute . इस बिंदु पर प्रोटीन 99% से अधिक शुद्ध होना चाहिए.
  14. एक Superdex-200 साइज़िंग स्तंभ (आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी - जीई हेल्थकेयर) से अधिक प्रोटीन गुजर द्वारा किसी भी प्रोटीन समुच्चय निकालें, बफर के साथ 25 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10% ग्लिसरॉल, 500 मिमी KCl, और 1 मिमी TCEP युक्त पूर्व equilibrated.

3. Tribolium castaneum बीटल संस्कृति

  1. टी. castaneum भृंग जहां शुरू में डॉ. एस ब्राउन, जीवविज्ञान के डिवीजन, कन्सास स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा एक उपहार के रूप में प्रदान की .
  2. प्रारंभ टी. castaneum संस्कृति के 28.5 ग्राम आटा और सूखे बेकर की खमीर के 1.5 ग्राम के साथ एक कंटेनर के लिए एक सौ वयस्क भृंग जोड़कर.
  3. स्टोर कमरे के तापमान पर और तीन से चार सप्ताह के लिए एक काले, आर्द्र वातावरण में बीटल संस्कृतियों प्रजनन और विकास के लिए अनुमति देने के लिए. एक बीटल भंडारण क्षेत्र में पानी युक्त एक आर्द्र वातावरण सुनिश्चित बीकर रखें.
  4. बीटल लार्वा के रूप में शाही सेना के अलगाव के लिए आवश्यक हार्वेस्ट. शेष लार्वा वयस्कों के लिए परिपक्व करने के लिए, उन्हें एक ही संस्कृति में रखने की अनुमति दें.
  5. हर महीने एक नया ताजा आटा और खमीर युक्त करने के लिए अपने भोजन की आपूर्ति की भरपाई फ्लास्क में सबसे सक्रिय भृंग (और नहीं एक सौ से) हस्तांतरण.

4. टी. castaneum कुल शाही सेना अलगाव

  1. हार्वेस्ट संस्कृति से 20 बीटल वयस्क बीट्लस और संस्कृति / आटा खमीर से उन्हें अलग से लार्वा (500-1000 लार्वा प्रत्येक संस्कृति के बीच में शामिल करना चाहिए). आटा या खमीर से पहले उन्हें पीस भृंग से जुड़ी कणों को हटा दें.
  2. बेंच क्षेत्र, मोर्टार और मूसल (के रूप में अच्छी तरह के दस्ताने के उपचार पर विचार) RNaseZap (Ambion इंक) के साथ इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया भृंग पीसने से पहले ribonucleases के सभी निशान हटाने जीवाणुरहित.
  3. तरल एन 2 में लार्वा पीस एक ठीक पाउडर में एक मोर्टार और मूसल और टी का उपयोगएक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पाउडर ransfer जबकि तरल 2 एन बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करना है कि पाउडर जमे हुए रहता है जब तक निकासी बफर जोड़ा जाता है.
  4. अतिरिक्त तरल N 2 पाउडर से लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें. बाद तरल 2 एन हवा हो गया है, निष्कर्षण बफर के 200 μl में बीटल पाउडर (20 ​​बीटल लार्वा प्रति) 25 मिमी Tris - एचसीएल, 5 मिमी β-mercaptoethanol, 1 मिमी EGTA, 0.1 मिमी benzamidine, 200 मिमी KCl, 10 युक्त homogenize % ग्लिसरॉल, 10 मिमी imidazole और 20U RNasin, 7.5 पीएच और सेते के 30 मिनट के लिए बर्फ पर.
  5. 4 में 20 मिनट के लिए 15,000 rpm पर homogenate ° अपकेंद्रित्र सी, सतह पर तैरनेवाला और फ्लैश एकत्र तरल एन में 2 नमूना फ्रीज. यदि आवश्यक हो, नमूने -80 ° रातोंरात सी पर संग्रहीत किया जा सकता है है.
  6. कुल शाही सेना का उपयोग RNeasy मिनी किट (Qiagen) निकालें.

5. Tribolium castaneum टेलोमिरेज के इन विट्रो में पुनर्गठन

  1. टी. के 50 μl साथ पुनः संयोजक उनकी टैग टीसी tert के 20 μg मिक्स castaneum कुल शाही सेना के बंधन बफर में 25 मिमी Tris - एचसीएल, 200 मिमी KCl, 10% ग्लिसरॉल, 5 मिमी β-mercaptoethanol, और 10 मिमी imidazole, पीएच 7.5 से युक्त.
  2. 22 पर दो घंटे के लिए कुल शाही सेना मिश्रण ° टी. सी - टीसी tert सेते castaneum lysate RNasin शाही सेना क्षरण को रोकने के अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में.
  3. नी NTA स्तंभ से अधिक जटिल शुद्ध lysate दोष और अधिक शाही सेना को हटाने के लिए.

6. टेलोमिरेज दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल assays (टीआरएपी)

  1. शुद्ध नी NTA टी. के 4 μg मिक्स 50 μl बढ़ाव बफर में castaneum टेलोमिरेज युक्त 20 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच - 8.3), 7.5 मिमी 2 MgCl, 63 मिमी KCl, 0.05% के बीच 20, 1 मिमी EGTA, 0.01% BSA, 0.5 मिमी dNTPs, 1 सुक्ष्ममापी TCAs - टीएस डीएनए (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 ') प्राइमर, और 30 में मिश्रण सेते ° 60 मिनट के लिए सी पुनर्गठन टी. द्वारा TCAs - टीएस डीएनए प्राइमर के बढ़ाव की अनुमति castaneum टेलोमिरेज.
  2. प्रतिक्रिया मिश्रण को phenol क्लोरोफॉर्म की एक बराबर मात्रा जोड़कर लम्बी एकल असहाय डीएनए (ssDNA) निकालें. हिलाएँ मिश्रण धीरे जब तक पायस सजातीय है.
  3. पांच मिनट के लिए 12,000 rpm पर 4 में नमूना अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस contaminants से ssDNA अलग करने के लिए.
  4. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए नमूने के शीर्ष जलीय परत अंतरण; 10 मिमी NaOAc (5.0 पीएच) के अंतिम एकाग्रता, 2 MgCl के 1 मिमी, और 66.4% EtOH और तब नमूना अनुमति -20 पर रात में वेग जोड़ ° सी.
  5. तीस मिनट के लिए 15,000 rpm पर 4 में नमूना ° उपजी ssDNA गोली सी स्पिन. एक समाधान का उपयोग pipettor छानना और तब नमूना के लिए 70% की 200 μl EtOH जोड़ने के लिए नमूना से शेष NaOAc और 2 MgCl धोने है . पांच मिनट के लिए एक ही गति और तापमान पर फिर से गोली नमूना नमूना अपकेंद्रित्र.
  6. EtOH समाधान का उपयोग कर एक pipettor छानना और इथेनॉल के शेष निशान हटाने Eppendorf ट्यूब तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खुला सेते के लिए अनुमति देता है. नमूने में मौजूद इथेनॉल होने पीसीआर प्रवर्धन कदम के साथ हस्तक्षेप करेगा.
  7. 10 Tris - एचसीएल (पीएच 8) मिमी, 50 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 100 सुक्ष्ममापी dNTPs (dATP युक्त पीसीआर प्रतिक्रिया बफर के 50 μl में ssDNA गोली Resuspend (टेलोमिरेज लम्बी उत्पाद और TCAs - टीएस प्राइमर युक्त) , और dGTP dTTP), 10 सुक्ष्ममापी [32 पी] dCTP, 1 सुक्ष्ममापी TCAs-CX (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') प्राइमर और 1.25 यू Taq डीएनए पोलीमरेज़.
  8. पीसीआर टेलोमिरेज बढ़ाव उत्पादों (94 ° ° के लिए सी सी 30 सेकंड के लिए, 50 ° सी 30 सेकंड के लिए, और 72 1 मिनट के 29 चक्रों) को बढ़ाना है, ताकि वे एक 12% polyacrylamide जेल पर दिखाई दे रहे हैं.
  9. Tris - borate EDTA (TBE) 44.5 मिमी Tris, 44.5 मिमी बोरिक एसिड, 1 मिमी EDTA, तीस मिनट के लिए 8 पीएच पहले पीसीआर नमूने को चलाने के लिए युक्त बफर चलाने के साथ 12% की जेल पूर्व चलाते हैं. बाद पूर्व चल रहा है और पीसीआर प्रतिक्रियाओं के साथ जेल लोड हो रहा है, 185 वोल्ट में 1.5-2 घंटे के लिए सेल्सियस या बर्फ पर 4 डिग्री पर जेल चला.
  10. जेल सूखी और भास्वर इमेजिंग प्लेट का उपयोग करने के लिए गतिविधि कल्पना.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के बाद शुद्ध टीसी tert का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है . शुद्धि के बाद केंद्रित प्रोटीन 12% एसडीएस - polyacrylamide जेल पर चलाया जाता है और 99 से अधिक शुद्ध% (2A चित्रा) होना दिखाया है. आकार अपवर्जन chromatogram (S200) भी प्रदान की जाती है (चित्रा 2B) शुद्धता और शुद्ध प्रोटीन नमूना से समुच्चय के अभाव का प्रदर्शन. सभी शुद्धि कदम पूरा हो गया है के बाद 5 मिलीग्राम प्रोटीन की उपज आमतौर पर हालांकि अंतिम उपज भिन्न हो सकते हैं प्राप्त की है.

पुनर्गठन टी. के लिए एक प्रतिनिधि टीआरएपी परख castaneum टेलोमिरेज 3 चित्र में दिखाया गया है के रूप में पहले मिशेल एट अल द्वारा रिपोर्ट 12. कदम वार टेलोमिरेज उत्पादों की सीढ़ी 1 गली में देखा जा सकता है, तथापि,वे दोनों RNase इलाज और 2 गलियों और 3 क्रमशः में टेलोमिरेज tert सक्रिय साइट उत्परिवर्ती नमूने (D251A) में अनुपस्थित रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. फ्लो चार्ट रीकॉम्बीनैंट टीसी tert के पुनर्गठन में शामिल कदम की. सबसे पहले, पुनः संयोजक टीसी tert ई. में अधिक व्यक्त कोलाई. प्रोटीन फिर निकल, कटियन विनिमय, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध होता है. टी. castaneum भृंग घर में सुसंस्कृत हैं और उनके लार्वा कुल शाही सेना को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है. शुद्ध टीसी tert और कुल शाही सेना तो टेलोमिरेज RNP जटिल पुनर्गठन के लिए मिश्रित कर रहे हैं, और बाद में एक टीआरएपी परख RNP परिसर की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक सक्रिय टेलोमिरेज है.

चित्रा 2
चित्रा 2. आकार अपवर्जन और टीसी tert प्रोटीन की एसडीएस PAGE विश्लेषण chromatogram. (ए) 12% आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के बाद एसडीएस polyacrylamide टीसी tert प्रोटीन की जेल . टीसी tert प्रोटीन (70 केडीए) एसडीएस PAGE जेल पर तेजी से उत्प्रवासित क्योंकि यह एक उच्च isoelectric बिंदु (PI - 9.8) (बी) टीसी tert प्रोटीन के आकार अपवर्जन chromatogram (S200 Superdex). .

चित्रा 3
चित्रा 3. इन विट्रो में टीआरएपी assays के पुनर्गठन Tribolium castaneum टेलोमिरेज मिशेल एट अल से अनुकूलित 12. लेन 1: जंगली प्रकार टीसी tert और कुल शाही सेना बीटल लार्वा से अलग है . 2 लेन: जंगली प्रकार टीसी tert और RNase लार्वा कुल शाही सेना और सेल के अर्क का इलाज. 3 लेन: सक्रिय साइट उत्परिवर्ती टीसी (D251A) tert और बीटल लार्वा कुल लार्वा शाही सेना.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट की बड़ी मात्रा में के उत्पादन के लिए अनुमति देता है castaneum घुलनशील, संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय रूप में टेलोमिरेज tert. टीसी से अधिक अभिव्यक्ति tert की विधि या ऊपर कहा गया है उन लोगों से तापमान और घनत्व सेल में सूक्ष्म परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है और नाटकीय रूप से प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं. विशेष रूप से, हमने पाया है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं उत्प्रेरण पहले ऑप्टिकल घनत्व 600 एनएम पर 0.5 तक पहुँच जाता है, या 30 से कम तापमान डिग्री सेल्सियस प्रेरण से पहले, प्रोटीन उपज में एक महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है है.

शुद्धि के मामले में, टीसी tert प्रोटीन एक बुनियादी isoelectric बिंदु (PI - 9.8) है और इतना कटियन विनिमय स्तंभ के लिए कसकर बाँध की क्षमता लोड हो रहा है और उच्च नमक के साथ नमूना धोने के द्वारा एक शुद्ध प्रोटीन नमूना उपज शोषण किया जा सकता है सांद्रता. अगर ब्याज की एक प्रोटीन के लिए एक कम isoelectric बिंदु (PI <5) इस प्रोटोकॉल कटियन आयनों मुद्रा स्तंभ के लिए मुद्रा प्रतिस्थापन द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, और धोने शर्तों सबसे अच्छा प्रोटीन की शुद्धता को प्राप्त करने के लिए फिर से अनुकूलन थे.

एंजाइम कोडांतरण में, विधि यहाँ वर्णित केवल टेलोमिरेज holoenzyme की एक आंशिक पुनर्गठन के लिए है क्योंकि यह किसी भी टेलोमिरेज जुड़े प्रोटीन को शामिल नहीं करता है. हालांकि इन घटकों मौजूद नहीं हैं, पुनर्गठन टी. से पुनः संयोजक टीसी tert और कुल शाही सेना से मिलकर टेलोमिरेज castaneum लार्वा सक्रिय है के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है. टेलोमिरेज क्रोमोसोम के सिरों को कई समान दोहराता जोड़ने के लिए अद्वितीय क्षमता एक प्रक्रिया दोहराएँ जोड़ Processivity रूप में जाना जाता है, टीआरएपी जेल में उत्पादों की सीढ़ी द्वारा visualized किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुसंधान यहाँ प्रस्तुत स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग, एलिसन मेडिकल, वी और पन्ना मूलाधार द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rosetta(DE3)plysS Cells Novagen, EMD Millipore 70956
2YT Broth TEKnova, Inc. Y0215
IPTG Gold Biotechnology I2481C
MISONIX Sonicator 3000 Qsonica, LLC.
ÄKTA Purifier FPLC GE Healthcare
Ni-NTA Superflow Resin Qiagen 30410
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device EMD Millipore UFC903008
POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing Applied Biosystems 1-3359-06
POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing Applied Biosystems 1-2559-06
Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column GE Healthcare 17-5175-01
Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA Sigma-Aldrich P3803-100mL
RNaseZap Ambion AM9780
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega Corp. N251B
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies

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References

  1. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
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आण्विक जीवविज्ञान 53 अंक टेलोमिरेज प्रोटीन अभिव्यक्ति शुद्धि क्रोमैटोग्राफी शाही सेना अलगाव टीआरएपी
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Schuller, A. P., Harkisheimer, M.… More

Schuller, A. P., Harkisheimer, M. J., Skordalakes, E. In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase. J. Vis. Exp. (53), e2799, doi:10.3791/2799 (2011).

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