Summary
Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (
Abstract
Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) och beredning av den aktiva T. castaneum telomeras ribonucleoprotein (RNP) komplex in vitro.
Telomeras är en specialiserad omvänt transkriptas 1 som ger korta DNA-upprepningar, som kallas telomerer, till 3 "slutet av linjära kromosomer 2 som syftar till att skydda dem från end-to-end-fusion och nedbrytning. Efter DNA-replikation, är ett kort segment förlorat i slutet av kromosom 3 och utan telomeras, fortsätter cellerna att dela tills slutligen nå sin Hayflick Limit 4. Dessutom är telomeras vilande i de flesta kroppsceller 5 hos vuxna, men är aktiv i cancerceller 6 när det främjar cellen odödlighet 7.
Den minimala telomeras enzym består av två huvudkomponenter: proteinet subenheten (tert), som omfattar den katalytiska subenheten av enzymet och en integrerad RNA-komponenten (TER), som innehåller mallen TERT använder för att syntetisera telomerer 8,9. Före 2008 hade endast strukturer för enskilda telomeras domäner lösts 10,11. Ett stort genombrott inom detta område kom från bestämning av kristallstrukturen av den aktiva 12-, katalytisk subenhet T. castaneum telomeras, Tc TERT 1.
Här presenterar vi metoder för att producera stora mängder av de aktiva, lösligt Tc TERT för strukturella och biokemiska studier, och beredning av telomeras RNP-komplex in vitro-analyser telomerasaktivitet. En översikt över den använda experimentella metoder visas i figur 1.
Protocol
1. Expression av rekombinanta Tc TERT
- Inokulera 6 L i 2YT medier (6 x 2 L förbryllad Erlenmeyerkolvar innehåller ett L i 2YT buljong i varje) från sex färska plattor av omvandlas Rosetta (DE3) pLysS celler som innehåller syntetiska Tc TERT plasmid med en TEV cleavable N-terminal hexahistidine- tagg.
- Odla cellerna vid 37 ° C under omskakning vid 220 rpm till en OD 600 på 0,5-0,6.
- Framkalla protein uttryck genom att tillsätta 1 mM IPTG.
- Sänk temperaturen till 30 ° C, långsam skaka till 150 rpm, och låta cellerna att uttrycka proteiner för 4-5 h.
- Harvest cellerna genom centrifugering vid 4 ° C och 3500 rpm i 30 min.
- Resuspendera varje 1 pellet L cell i 20 ml buffert innehållande 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 0,5 M KCl, 15 mm Imidazol, 5 mm β-merkaptoetanol och 0,1 mM phenylmethyl sulphonyl fluorid (PMSF) och benzamidine.
- Flash frysa återsuspenderade cell blandningen genom att långsamt droppar celler i ett 50 ml plast koniska rör fyllt med flytande kväve så att varje droppe fryser vid nedslaget i den flytande N 2. Förvara frusna celler vid -80 ° C tills för protein rening.
2. Rening av Tc TERT
- Tina cellerna vid rumstemperatur tills en flytande konsistens har uppnåtts och sedan flytta till metall bägare på is sonication.
- Sonikera celler på is i 2 min i 30 sekunders intervaller med 30 sekunders pauser, vid ca 51 V om makt.
- Spinn ner lyserade celler vid 18.000 rpm i 20 minuter för att separera lösliga och olösliga protein fraktioner och ta försiktigt bort supernatanten för Nickel affinitetskromatografi.
- Jämvikt Ni-NTA (nickel-nitrilotriättiksyra) kolumn med buffert innehållande 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 0,5 M KCl, 15 mm imidazol, 5 mm β-merkaptoetanol och 0,1 mM PMSF och benzamidine.
- Ladda supernatant över kåda och samla flödet genom.
- Tvätta kolonnen med buffert innehållande 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mm KCl, 15 mm imidazol, 5 mm β-merkaptoetanol och 0,1 mM PMSF att ta bort alla rester och icke-specifikt bundet proteiner.
- Eluera Tc TERT av Ni-NTA harts med en imidazol lutning på 15 - 300 mm och samla 3 ml fraktioner för SDS PAGE analys.
- Använd PAGE analys för att fastställa vilka fraktioner innehåller Tc TERT protein och koncentrera dessa fraktioner i ett Amicon 30 kDa (Millipore) filter.
- Koncentrera Tc TERT fraktioner till en volym mindre än 10 ml för ytterligare rening.
- TC TERT renas ytterligare över katjoner Jonbytarkolonnen (HS Poros, Applied Biosystems) till jämvikt med buffert innehållande 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mm KCl, och 1 mm DTT.
- Ladda protein blandningen på HS Poros kolumnen och tvätta den för att ta bort alla protein och nukleinsyra föroreningar syra.
- Tvätta kolonnen med buffert innehållande 500 mm KCl följt av 700 mM KCl att undanröja eventuella återstående föroreningar.
- Eluera Tc TERT protein från HS Poros kolonnen med 1 M KCl buffert. Vid denna punkt protein bör vara mer än 99% ren.
- Ta bort alla protein aggregat genom att skicka protein över en Superdex-200 storlek kolumn (storlek uteslutning kromatografi - GE Healthcare), pre-jämvikt med buffert innehållande 25 mM Tris, pH 7,5, 10% glycerol, 500 mm KCl, och 1 mm TCEP.
3. Tribolium castaneum skalbagge kultur
- T. castaneum skalbaggar där ursprungligen som en gåva av Dr S. Brown, Avdelningen för biologi, Kansas State University.
- Starta T. castaneum kulturen genom att lägga hundra vuxna skalbaggar till en behållare med 28,5 g mjöl och 1,5 g torkad bagerijäst.
- Förvara skalbagge kulturer vid rumstemperatur och i en mörk, fuktig miljö i tre till fyra veckor för att möjliggöra reproduktion och tillväxt. Placera en bägare med vatten i skalbaggen lagringsutrymmen för att säkerställa en fuktig miljö.
- Skörda skalbaggslarver som behövs för RNA-isolering. Låt resterande larverna att mogna till vuxna, att hålla dem i samma kultur.
- Varje månad överförs de mest aktiva skalbaggarna (inte mer än ett hundra) i en ny kolv med färskt mjöl och jäst för att fylla sin livsmedelsförsörjning.
4. T. castaneum Total RNA isolering
- Harvest 20 skalbaggslarver från kulturen (varje kultur bör innehålla mellan 500-1000 larver) genom att separera dem från vuxna skalbaggar och mjölet / jästkultur. Eliminera mjöl eller partiklar jäst bifogas skalbaggar innan de mals dem.
- Sterilisera bänken området, murbruk och mortelstöt (överväg att behandla handskar också) används för detta förfarande med RNaseZap (Ambion, Inc.) för att avlägsna alla spår av ribonucleases innan slipning av skalbaggar.
- Grind larver i flytande N 2 till ett fint pulver med en mortel och tverför pulvret till ett 50 ml centrifugrör samtidigt behålla den flytande N 2 för att säkerställa att pulvret stannar frysta tills extraktionsbuffert läggs till.
- Låt överflödig vätska N 2 avdunsta från pulver. Efter flytande N 2 avdunstat, homogenisera skalbaggen pulver i 200 l extraktionsbuffert (per 20 skalbaggslarver) innehållande 25 mM Tris-HCl, 5 mm β-merkaptoetanol, 1 mm EGTA, 0,1 mM benzamidine, 200 mm KCl, 10 % glycerol, 10 mm imidazol och 20U av RNasin, pH 7,5 och inkubera på is i 30 minuter.
- Centrifugera homogenatet vid 15.000 rpm under 20 minuter vid 4 ° C, samla supernatanten och blixt frysa provet i flytande N 2. Vid behov kan proverna förvaras vid -80 ° C över natten.
- Extrahera den totala RNA med RNeasy Mini Kit (Qiagen).
5. In vitro-beredning av Tribolium castaneum telomeras
- Blanda 20 mikrogram av rekombinant taggade Hans-Tc TERT med 50 ìl av T. castaneum totala RNA i bindande buffert innehållande 25 mM Tris-HCl, 200 mm KCl, 10% glycerol, 5 mm β-merkaptoetanol och 10 mm imidazol, pH 7,5.
- Inkubera Tc TERT - totala RNA blandningen i två timmar vid 22 ° C i T. castaneum lysat i närvaro av RNasin inhibitor för att förhindra RNA nedbrytning.
- Rena komplex med en Ni-NTA kolumnen för att ta bort lysat orenheter och överskott RNA.
6. Telomeras upprepa förstärkning protokoll (fälla) analyser
- Blanda 4 mikrogram av Ni-NTA renat T. castaneum telomeras i 50 l töjning buffert innehållande 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 mM MgCl 2, 63 mm KCl, 0,05% Tween 20, 1 mm EGTA, 0,01% BSA, 0,5 mm dNTPs, 1 mikroM TCAS-TS DNA primer (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 ') och inkubera blandningen vid 30 ° C i 60 minuter så att töjning av TCAS-TS DNA primer med den färdigberedda T. castaneum telomeras.
- Extrahera den långsträckta enda DNA (ssDNA) genom att lägga till en lika stor mängd fenol kloroform till reaktionsblandningen. Skaka blandningen försiktigt tills emulsionen är homogen.
- Centrifugera provet vid 12.000 rpm i fem minuter vid 4 ° C för att separera ssDNA från föroreningar.
- Överför den övre vattenskiktet av provet med en 1,5 ml Eppendorf-rör, lägg till en slutlig koncentration av 10 mM NaOAc (pH 5,0), 1 mm av MgCl 2 och 66,4% EtOH och låt provet att fälla över natten vid -20 ° C.
- Spin provet vid 15.000 rpm i trettio minuter vid 4 ° C till pellets de utfällda ssDNA. Dekantera den lösningen med en pipett och sedan lägga till 200 l med 70% EtOH till provet för att tvätta återstående NaOAc och MgCl 2 från provet. Centrifugera provet i fem minuter med samma hastighet och temperatur på nytt pellets provet.
- Dekantera den EtOH lösningen med en pipett och avlägsna kvarvarande spår av etanol genom att låta Eppendorf-rör för att inkubera öppna i rumstemperatur i tre minuter. Med etanol som finns i provet kommer att störa PCR-amplifiering steg.
- Resuspendera ssDNA pellet (innehåller telomeras långsträckt produkten och TCA-TS primer) i 50 l av PCR-reaktionen buffert innehållande 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mm KCl, 2 mM MgCl 2, 100 mikroM dNTPs (dATP, dGTP och dTTP), 10 mikroM [32 P] dCTP, 1 mikroM TCAS-CX primer (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3) och 1,25 U Taq DNA-polymeras.
- PCR förstärka produkter telomeras töjning (29 cykler av 94 ° C i 30 sekunder, 50 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 1 minut), så att de är synliga på en 12% polyakrylamidgel.
- Pre-köra 12% gel med tris--EDTA (TBE) kör buffert innehållande 44,5 mM Tris, 44,5 mm borsyra, 1 mM EDTA, pH 8 i trettio minuter innan du kör PCR-prover. Efter pre-drift och ladda gelen med PCR reaktioner, Kör gelen vid 185 volt för 1,5-2 timmar på 4 ° C eller på is.
- Torka gelen och använda fosfor avbildning plattan för att visualisera verksamheten.
7. Representativa resultat:
Ett exempel på det renade Tc TERT efter storlek utanförskap kromatografi visas i figur 2. Proteinet koncentrerad efter rening körs på en 12% SDS-polyakrylamidgel och visar sig vara mer än 99% ren (Figur 2A). Storleken utslagning (S200) kromatogram också (Figur 2B) för att visa renhet och brist på aggregat från renat protein provet. En avkastning på 5 mg protein efter alla reningssteg har slutförts är vanligtvis erhålls även om den slutliga avkastningen kan variera.
En representant TRAP analys för den rekonstituerade T. castaneum telomeras visas i figur 3 som tidigare rapporterats av Mitchell et al. 12. Den stegvis stege av telomeras produkter kan ses i körfält 1, dockde är frånvarande i både det behandlade RNase telomeras och TERT aktiva webbplatsen mutant (D251A) prover i körfält 2 respektive 3.
Figur 1. Flödesschema av stegen i beredning av rekombinanta Tc TERT. För det första är rekombinanta Tc TERT överrepresenterade i E. coli. Proteinet renas sedan av nickel, katjonbyteskapacitet och storlek utanförskap kromatografi. T. castaneum skalbaggar odlas i hus och deras larver används för att isolera den totala RNA. Den renade Tc TERT och totala RNA blandas sedan att rekonstruera den komplicerade telomeras RNP, och en efterföljande TRAP analys används för att bekräfta RNP komplexet är ett aktivt telomeras.
Figur 2. Storlek utanförskap kromatogram och SDS PAGE analys av Tc TERT protein. (A) 12% SDS-polyakrylamidgel av TC TERT proteinet efter storlek utanförskap kromatografi. TC TERT protein (70 kDa) vandrar snabbare på SDS PAGE gelen eftersom det har en hög isoelektriska punkt (pi - 9,8). (B) Storlek uteslutning kromatogram (Superdex S200) av TC TERT protein.
Figur 3. TRAP analyser av in vitro-rekonstituerade Tribolium castaneum telomeras anpassas från Mitchell et al. 12. Körfält 1: vildtyp Tc TERT och totala RNA isoleras från skalbaggslarver. Körfält 2: vildtyp Tc TERT och RNas behandlas RNA larver totalt och extrakt cell. Lane 3: aktiv site mutant Tc TERT (D251A) och skalbaggslarver totala RNA larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här ger för produktion av stora mängder av den katalytiska subenheten av T. castaneum telomeras TERT i löslig, aktiv form av strukturella och biokemiska studier. Metoden av Tc TERT över-uttryck är känslig för subtila förändringar i temperatur eller celltäthet från de ovan och kan dramatiskt påverka nivåerna av protein uttryck. Specifikt har vi funnit att förmå cellerna för proteinuttryck innan den optiska densiteten når 0,5 vid 600 nm, eller sänka temperaturen till 30 ° C före induktion, leder till en betydande minskning av proteinet avkastning.
När det gäller rening har Tc TERT proteinet en grundläggande isoelektriska punkt (pi - 9,8) och så dess förmåga att binda hårt till katjoner Jonbytarkolonnen kan utnyttjas för att ge ett rent protein prov med lastning och tvätta provet med hög salt koncentrationer. Om ett protein av intresse var att ha en låg isoelektriska punkt (pi <5) Detta protokoll skulle kunna anpassas genom att ersätta de katjoner utbyte mot en anjon-Jonbytarkolonnen, och åter optimera tvätt förutsättningar för att uppnå bästa proteinet renhet.
Vid sammanställandet av enzymet, som beskrivs metoden här är bara en partiell upplösning av telomeras holoenzyme eftersom den inte innehåller någon telomeras associerade proteiner. Även om dessa komponenter är inte närvarande, den rekonstituerade telomeras består av rekombinanta Tc TERT och totala RNA från T. castaneum larver är verksam som visas i figur 3. Den unika förmåga för telomeras att lägga till flera identiska upprepar till ändarna på kromosomerna kan en process som kallas Upprepa Tillägg Processivity, att visualiseras genom stegen av produkter i fällan gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den forskning som presenteras här stöddes av Pennsylvania Department of Health, Ellison Medical, V och grunden Emerald.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
