Summary
Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT izolasyonu (yöntemleri mevcut
Abstract
Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) izolasyonu ve aktif T. sulandırıldıktan yöntemleri mevcut in vitro castaneum telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık.
Telomeraz, bir uçtan-uca füzyon ve bozulmaya karşı korumak için hizmet doğrusal kromozomların 2 3 'sonuna kadar, telomer denilen kısa DNA tekrarlar, ekleyen özel bir ters transkriptaz 1. DNA replikasyonu takiben, kısa segment 3 kromozom sonunda kaybolur ve telomeraz olmadan sonunda kendi Hayflick Sınırı 4 ulaşana kadar, hücre bölünmesi devam eder. Ayrıca, telomeraz yetişkinlerde en somatik hücre 5 içinde uyuyan, ancak kanser hücreleri, hücre ölümsüzlük 7 teşvik 6 aktif .
Enzimin katalitik alt birim ve şablon TERT telomer 8,9 sentezlemek için kullandığı içeren ayrılmaz bir RNA bileşeni (TER), oluşan protein altbirim (TERT), minimal telomeraz enzimi iki temel bileşenden oluşmaktadır. 2008'den önce, ayrı ayrı telomeraz etki alanları için sadece yapıları 10,11 çözüldü. T. katalitik altbirim aktif 12 kristal yapının belirlenmesi, bu alanda büyük bir atılım geldi castaneum telomeraz, Tc TERT 1.
Burada, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif, çözünür Tc TERT ve telomeraz aktivitesi testleri için in vitro telomeraz RNP kompleks sulandırıldıktan büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sunuyoruz. Kullanılan deneysel yöntemler hakkında genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
Protocol
1. Rekombinant Tc TERT Açıklanması
- TEV cleavable N-terminali ile sentetik Tc TERT plazmid içeren (de3) Rosetta dönüştürülmüş pLysS hücreleri altı taze plakalardan 2YT medya 6 L (6 x 2 L 1 L 2YT suyu içeren her Erlenmeyer şişeler şaşkın) İnokülasyon hexahistidine etiket.
- 37 ° hücrelerin büyümesine ° C ise 0.5-0.6, OD 600 220 rpm sallayarak.
- 1 mM IPTG ekleyerek protein ifadesi neden.
- 30 sıcaklığını azaltın ° C, 150 rpm sallayarak yavaş ve hücreleri 4-5 saat protein ifade izin
- Santrifüj yoluyla hasat hücreler 4 ° C ve 30 dakika 3500 rpm.
- 20 ml 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 0.5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM phenylmethyl Sülfonil florür (PMSF) ve benzamidine içeren tampon her 1 L hücre pelletini tekrar
- Flaş dondurma hücrelerin yavaş yavaş her damla sıvı N 2 darbe donuyor böylece sıvı nitrojen ile dolu bir 50 ml plastik konik tüp içine damlayan yeniden süspanse hücre karışımı . , -80 Donmuş hücreleri Mağaza ° C protein saflaştırılması için hazır olana kadar.
2. Tc TERT saflaştırılması
- Çözülme hücreleri oda sıcaklığında sıvı bir kıvama kadar ulaştı ve ardından sonication buz metal bardak taşımaktır.
- 30 saniyede yaklaşık 51 W güç, duraklar, 30 saniyelik aralıklarla 2 dakika süreyle buz hücrelerinin sonikasyon.
- Çözünür ve çözünmez protein fraksiyonları ayrı ve dikkatle Nikel afinite kromatografisi süpernatant kaldırmak için 20 dakika süreyle 18.000 rpm parçalanmış hücreleri aşağı spin.
- Ni-NTA (nikel-nitrilotriacetic asit) 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 0.5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM PMSF ve benzamidine içeren tamponu ile sütun dengelenmesi.
- Yük ve reçine üzerinde süpernatant üzerinden akışını toplamak.
- Sütun bütün kalıntı ve non-spesifik bağlı proteinler kaldırmak için 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM PMSF içeren tamponu ile yıkayın.
- Zehir Tc, 15 imidazol degrade kullanarak Ni-NTA reçine TERT - 300 mM ve SDS PAGE analizi için 3 ml kesirler toplamak .
- Hangi kesirler Tc TERT protein içerir belirlemek ve bu kesirler bir Amicon 30 kDa (Millipore) filtresi konsantre SAYFA analiz kullanın.
- Tc TERT kesirler bir ses daha ileri saflaştırma işlemi için en az 10 ml konsantre ol.
- Tc TERT katyon değişim sütun (HS Poros, Applied Biosystems) 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCI, 1 mM DTT içeren tampon ile ön dengelenmiş üzerinde daha arındırılır.
- HS Poros sütun üzerinde protein karışımı yerleştirin ve tüm protein ve nükleik asit kirleticiler çıkarmak için yıkama.
- 500 mM KCl kalan tüm kirleri çıkarmak için 700 mM KCl içeren tamponu ile sütun yıkayın.
- 1 M KCI tamponu ile HS Poros sütun kapalı Tc TERT protein Zehir. Bu noktada daha fazla protein% 99 saflıkta olmalıdır.
- Protein geçen bir Superdex-200 boyutlandırma sütun (boyut dışlama kromatografisi - GE Healthcare) üzerinde herhangi bir protein agrega çıkarın, 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCI, 1 mM TCEP içeren tampon ile ön-dengelenmiş.
3. Tribolium castaneum böceği kültür
- T. castaneum böcekler başlangıçta Dr. S. Brown, Biyoloji Bölümü, Kansas Eyalet Üniversitesi tarafından bir hediye olarak verilmiştir.
- Başlangıç T. bir kapta un 28.5 g ve 1.5 g kuru ekmek mayası ile yüz yetişkin böcekler ekleyerek castaneum kültür.
- Oda sıcaklığında ve 3-4 hafta boyunca karanlık, nemli ortamlarda saklayın böceği kültürlerde üreme ve büyüme için izin vermek. Böceği depolama alanında su içeren nemli bir ortam sağlamak için bir behere koyun.
- RNA izolasyonu için gerekli böceği larvaları Hasat. Kalan larvalar aynı kültürü tutmak, yetişkin olgun izin verin.
- Her ay en aktif böcekler (en fazla yüz daha), kendi gıda tedarik doldurmak için taze un ve maya içeren yeni bir balona transfer.
4. T. castaneum toplam RNA izolasyonu
- Hasat 20 yetişkin böcekler ve un / maya kültürü ayırarak kültür böceği larvaları (her kültür, 500-1000 larvaları arasında içermelidir). Un veya taşlama önce böcekler bağlı maya parçacıkları ortadan kaldırır.
- Tezgah alanı, harç ve böcekler taşlama önce ribonucleases tüm izlerini kaldırmak için RNaseZap (Ambion A.Ş.) ile bu işlem için kullanılan havaneli (eldiven gibi tedavi düşünün) sterilize edin.
- Sıvı N 2, bir havanda ve t kullanarak ince bir toz haline larvaları Grindtoz ekstraksiyon tamponu eklenir kadar toz donmuş kalmasını sağlamak için sıvı N 2 korurken, 50 ml santrifüj tüpüne ransfer.
- Aşırı sıvı N 2 toz buharlaştırmak için izin verin. Sıvı N 2 buharlaştı sonra, 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EGTA, 0,1 mM benzamidine, 200 mM KCl, 10 içeren ekstraksiyon tamponu 200 ul böceği tozu (20 böceği larvaları başına) homojenize gliserol,% 10 mM, 30 dakika boyunca buz üzerinde RNasin, pH 7.5 ve inkübe imidazol ve 20U.
- 4 20 dakika 15.000 rpm'de Homojenat Santrifüj ° C, supernatant ve flash toplamak sıvı N 2 örnek dondurmak. Gerekirse, numuneler -80 ° C gece boyunca saklanabilir.
- RNeasy Mini Kiti (Qiagen) kullanılarak total RNA ayıklayın.
5. Tribolium castaneum telomeraz in vitro sulandırıldıktan
- T. 50 ul ile 20 mg rekombinant Onun etiketli Tc TERT karıştırın castaneum toplam RNA bağlayıcı tampon içeren 25 mM Tris-HCl, 200 mM KCl,% 10 gliserol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 10 mM imidazol, pH 7.5.
- Toplam RNA karışımı az iki saat için 22 ° C T. - Tc TERT inkübe RNA bozulmasını önlemek için RNasin inhibitörü varlığı castaneum lizat.
- Ni-NTA sütun üzerinde lizat kirleri ve aşırı RNA kaldırmak için karmaşık arındırın.
6. Telomeraz tekrar amplifikasyon protokolü (TRAP) deneyleri
- Ni-NTA saflaştırılmış T. 4 mikrogram Mix 50 ul uzama tampon castaneum telomeraz içeren 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 7.5 mM MgCl 2, 63 mM KCl,% 0.05 'Tween 20, 1 mM EGTA,% 0.01 BSA, 0.5 mM dNTP, 1 mcM TCAS-TS DNA astar (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), ve 30 ° C 60 dakika, sulandırılmış T. TCAS-TS DNA astar uzama izin karışımı inkübe castaneum telomeraz.
- Reaksiyon karışımı eşit miktarda fenol kloroform eklenerek uzatılmış tek iplikli DNA (ssDNA) ayıklayın. Emülsiyon homojen karışımı hafifçe kadar çalkalayınız.
- Örnek Santrifüj beş dakika 12.000 rpm'de 4 ° C kirleticilerden uzak ssDNA ayrı.
- 1,5 ml Eppendorf tüp örnek üst sulu tabaka transfer nihai konsantrasyonu 10 mM NaOAc (pH 5.0), 1 mM MgCl 2 ve% 66.4 EtOH ve sonra örnek -20 geceleme çökelmesine izin ° C.
- 4 otuz dakika 15.000 rpm'de örnek Spin ° C pelet çöktürülmüş ssDNA. Bir pipet kullanarak çözüm Durusu ve sonra, kalan NaOAc ve MgCl 2 örnek yıkamak için örnek% 70 EtOH 200 ul ekleyin . Aynı hız ve sıcaklık örnek yeniden pelet az beş dakika için örnek santrifüjleyin.
- Bir pipet kullanarak EtOH çözüm Durusu ve Eppendorf tüp, üç dakika boyunca oda sıcaklığında açık inkübe izin vererek etanol kalan izlerini ortadan kaldırmak. Örnek etanol mevcut olan PCR adım ile müdahale edecektir.
- PCR reaksiyon tamponu içeren 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 100 mcM dNTP (dATP, 50 ul ssDNA pelet (telomeraz uzatılmış ürün ve TCAS-TS astar içeren) yeniden süspanse dGTP ve dTTP), 10 mcM [32 P] dCTP, 1 mcM TCAS-CX astar (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') ve 1.25 U Taq DNA polimeraz.
- PCR% 12 poliakrilamid jel üzerinde görünür, böylece telomeraz uzama ürünleri (94 ° C, 30 saniye boyunca 50 ° C 30 saniye ve 72 ° C için 1 dakika 29 siklus) yükseltmek.
- Tris-borat-EDTA (TBE) 44.5 mM Tris, 44.5 mM Borik Asit, 1 mM EDTA, otuz dakika, pH 8 çalıştırmadan önce PCR örnekleri içeren tampon çalışan% 12 jel Öncesi çalıştırın. Ön çalışan ve PCR reaksiyonları ile jel yükledikten sonra 1.5-2 saat boyunca, 4 ° Celsius veya buz üzerinde 185 Volt jel çalıştırın.
- Jel Kuru ve aktivite görselleştirmek için fosfor görüntüleme plaka kullanın.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Boyut dışlama kromatografisi sonra saflaştırılmış Tc TERT bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Arıtma sonra konsantre protein,% 12 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalışan ve saf fazla% 99 (Şekil 2A) olduğu gösterilmiştir. Boyutu hariç tutma (S200) kromatogram ve aynı zamanda saflık ve saflaştırılmış protein örnek agrega eksikliği göstermek için (Şekil 2B). Son verim değişebilir rağmen tamamlanmıştır tüm arıtma adımlardan sonra 5 mg protein verimi elde edilir.
Sulandırılmış T. için bir temsilci TRAP yönteminin Mitchell ve arkadaşları tarafından rapor olarak castaneum telomeraz Şekil 3'te gösterilmiştir. 12. Ancak, telomeraz ürünleri basamaklı merdiveni şeritli 1 görülebilirşeritleri 2 ve 3 sırasıyla RNaz tedavi telomeraz ve TERT aktif sitesi mutant (D251A) örnekleri mevcut değildir.
Şekil 1. Rekombinant Tc TERT sulandırıldıktan ilgili adımları akış şeması. İlk olarak, rekombinant Tc TERT E. fazla ifade edilir coli. Protein sonra nikel, katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi arındırılır. T. castaneum böcekler evde kültür ve larvaların total RNA izole etmek için kullanılır. Aktif telomeraz saflaştırılmış Tc TERT ve toplam RNA sulandırmak telomeraz RNP kompleksi sonra karıştırılır ve bir sonraki TRAP yönteminin RNP kompleks onaylamak için kullanılır.
Şekil 2. Tc TERT protein Boyut dışlama kromatogram ve SDS PAGE analizi. Tc TERT protein boyut dışlama kromatografisi sonra (A)% 12 SDS-poliakrilamid jel. Yüksek bir izoelektrik noktası (pI 9.8), çünkü Tc TERT protein (70 kDa) SDS PAGE jel üzerinde daha hızlı geçirir. Tc TERT protein (B) Ölçü dışlama kromatogram (Superdex S200) .
Şekil 3. In vitro TRAP deneyleri Tribolium castaneum telomeraz Mitchell ve ark adapte sulandırılmış 12. Lane 1: vahşi tip Tc TERT ve toplam RNA izole böceği larvaları. Lane 2: vahşi tip Tc TERT ve RNaz larvaları toplam RNA ve hücre özleri tedavi. Lane 3: aktif sitesi mutant Tc TERT (D251A) ve böcek larvaları toplam larva RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemi büyük miktarlarda T. katalitik subunit üretim için izin verir çözünür, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif olarak castaneum telomeraz TERT. Tc TERT üzerinden ifade yöntemi yukarıda belirtilen sıcaklık ya da hücre yoğunluğu ince değişikliklere duyarlı ve protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde etkileyebilir . Özellikle, biz optik yoğunluğu 600 nm'de 0.5 ulaşmadan önce protein ekspresyonu hücreleri indükleyen ya da sıcaklık düşürücü 30 ° C indüksiyon öncesi, protein verimi önemli bir azalmaya yol açtığını buldular.
Arınma açısından, Tc TERT protein temel bir izoelektrik noktası (pI 9.8) ve katyon değişim sütun sıkıca bağlamak kabiliyeti yüksek tuz ile örnek yükleme ve yıkama saf protein örneği verim yararlanılabilir konsantrasyonları. Ilgi bir protein (pI <5) Bu protokol, anyon-değişim bir sütun için katyon değişim yerine adapte edilmiş, ve yıkama koşulları en iyi protein saflığı elde etmek için yeniden optimize olabilir düşük bir izoelektrik noktası var.
Enzim montaj yöntemi, burada açıklanan herhangi bir telomeraz ilişkili proteinler içermez çünkü sadece telomeraz holoenzyme kısmi bir sulandırıldıktan. Bu bileşenlerin mevcut olmamasına rağmen, T. rekombinant Tc TERT ve toplam RNA oluşan sulandırılmış telomeraz Şekil 3'te görüldüğü gibi castaneum larvaları aktiftir. Kromozom uçlarında birden fazla özdeş tekrarlar eklemek için telomeraz için benzersiz yeteneği Tekrar ilavesi Processivity olarak bilinen bir süreç, TRAP jel ürünlerinin merdiveni ile görünür olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Pennsylvania Sağlık Bölümü, Ellison Tıp, V ve The Emerald Vakıflar tarafından desteklenen araştırma sundu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen, EMD Millipore | 70956 | |
| 2YT Broth | TEKnova, Inc. | Y0215 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C | |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Healthcare | ||
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | EMD Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803-100mL | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H.
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
