Summary
وصفت وسيلة فعالة لتقييم التعرض سطح البروتينات البريميات. وهو مصمم خصيصا لطريقة لتجنب اضطراب الغشاء الخارجي للخلايا هشة البريميات. هذا الأسلوب يتطلب العمل من الضوابط سلبية عديدة لتقييم سلامة الغشاء الخارجي ونوعية رد فعل الأجسام المضادة.
Abstract
وتشارك البروتينات السطحية الجرثومي في اتصال مباشر مع الخلايا المضيفة وامتصاص المغذيات من البيئة 1. لهذا السبب ، لا يمكن توطين الخلوية توفير نظرة ثاقبة لدور وظيفي من البروتينات البكتيرية. توطين سطح البروتينات البكتيرية هي خطوة مهمة نحو تحديد عوامل الفوعة تشارك في آليات المرضية.
قد طرق تجزئة البريميات الأغشية 2-5 تكون انتقائية لفئة معينة من الغشاء الخارجي ، البروتينات (خطط إدارة المكاتب) ، مثل البروتينات الدهنية عبر الغشاء مقابل خطط إدارة المكاتب ، وتؤدي بالتالي إلى الخطأ في التصنيف. هذا هو الأرجح بسبب الاختلافات الهيكلية ، وكيف أنها ترتبط إلى الغشاء الخارجي. وترتبط مع البروتينات الدهنية الأغشية عن طريق التفاعل بين مسعور شاردة الدهن N - الطرفي (ثلاثة أحماض الدهنية) ، والدهون الفوسفاتية طبقة ثنائية الدهن 6 ، 7. في المقابل ، عادة ما يتم دمج خطط إدارة المكاتب عبر الغشاء في طبقة ثنائية المادة الدهنية التي متقابلة الزمر β - ترتيب الأوراق في بنية برميل مثل 8 و 9. بالإضافة إلى ذلك ، وجود بروتين في الغشاء الخارجي ، لا يضمن بالضرورة أن يتعرض للبروتين أو المجالات على السطح. ومن المعروف الأغشية الخارجي ملتوياتي أن تكون أساليب هشة ، وبالتالي تنطوي على تلاعب لطيف تتطلب من الخلايا وإدراج الفرعي سطح البروتين ضوابط لتقييم سلامة الغشاء الخارجي.
هنا ، ونحن تقديم مقايسة التألق المناعي (IFA) طريقة لتقييم التعرض مباشرة على سطح البروتينات leptospires سليمة. ويستند هذا الأسلوب على الاعتراف البروتينات السطحية البريميات بواسطة أضداد المستضد محددة. هنا ، هي أجسام مضادة محددة لdetetcted OmpL54 10 aftero ملزمة لأصلي الحواتم السطح ، وعرضة للخطر. مقارنة تفاعل الأجسام المضادة لخلايا سليمة مقابل permeabilized تمكن تقييم توزيع الخلوية وجود أو عدم وجود البروتين بشكل انتقائي على سطح البريميات. وينبغي تقييم سلامة الغشاء الخارجي باستخدام أجسام مضادة لبروتين واحد أو أكثر تحت سطح الأرض ، وتقع يفضل أن تكون في الجبلة المحيطية.
ويمكن استخدام أسلوب تحليل ايفا سطح سطح التعرض لأي بروتين البريميات التي أضداد محددة متاحة. كلا من فائدة والحد من الأسلوب يعتمد على ما إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة قادرة على ربط الحواتم الأصلي. ربما منذ الأضداد غالبا ما تثار ضد بروتينات المؤتلف ، الحواتم الأصلي من البروتينات السطحية المعرضة لل، لا يمكن الاعتراف بها. ومع ذلك ، فإن الأسلوب ايفا السطح هو أداة قيمة لدراسة مكونات الأسطح البكتيرية سليمة. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب ليس فقط ولكن أيضا لleptospires اللولبيات الأخرى والبكتيريا سالبة الجرام. أقوى الاستنتاجات المتعلقة سطح التعرض للخطط إدارة المكاتب ، فمن المستحسن اتباع نهج شامل تشترك فيه عدة طرق توطين الخلية 10.
Protocol
1. التثبيت من البريمية على الشرائح الزجاجية
- البريمية interrogans هي فئة BSL2 الممرض. العمل مع الخلايا الحية فإنه يتطلب معالجة مناسبة ، مثل ارتداء القفازات ، معطف المختبر والخطوات pipetting في غطاء العقيمة.
- البريمية تنمو في EMJH medium11 ، على أن تستكمل مع مصل الأرنب 1 ٪ عند 30 درجة مئوية حتى تصل إلى منتصف إلى أواخر سجل في المرحلة (5 × كثافة 07-05 أكتوبر X الخلايا 8 10 / مل) لحوالي 6 أيام.
- حصاد الثقافة بواسطة الطرد المركزي في XG 2000 ~ لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة مخزنة بواسطة الطموح وطاف resuspend بلطف بيليه في الفوسفات الملحي (PBS) -5 ملي MgCl 2 ، pH7.2 إلى التركيز النهائي للخلايا 5 × 8 10 / مل.
- إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من اثنين وكذلك الشرائح الزجاجية واحتضان الغرفة في 30 دقيقة لمدة 80 درجة مئوية للسماح للخلايا التمسك به.
- إزالة بعناية السائلة التي تحتوي على الخلايا غير منضم بواسطة الطموح.
- الإصلاح البكتيريا المتبقية سليمة على الشرائح الزجاجية وذلك بإضافة 1 مل / بئر بارافورمالدهيد 2 ٪ في PBS - 5 MgCl 2 مم. احتضان لمدة 40 دقيقة حتى 30 درجة مئوية وهذه الشرائح ستكون لتقييم المياه السطحية المعرضة للبروتينات.
- للشرائح السيطرة شبه السطحية تقييم البروتينات ، permeabilize الغشاء الخارجي عن طريق تحديد مع 1 مل / 100 ٪ جيدا الجليد الباردة الميثانول. في احتضان -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الميثانول الأعمال بطرق عدة : فهو permeabilizes الغشاء الخارجي ، denaturates البروتينات ، والخلايا الإصلاحات على الشرائح الزجاجية.
- إزالة تثبيت الوكلاء بحسب الطموح.
2. وسم مع الاجسام المضادة المحددة
- كتلة غير محددة وملزمة وذلك بإضافة 1 مل / جيدا العازلة حظر (Difco البريمية EMJH التخصيب). في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- تمييع الضد معينة (أو الأرانب الأمصال المناعية الأضداد وحيدة النسيلة الماوس ، الأرنب النسائل المتعددة هنا الأمصال محددة لOmpL54 10 ، FlaA1 12 و 13 OmpL1) وقبل الأمصال المناعية التقشف أو الماوس السوائل التي لا تحتوي على الأضداد الأرنب (عند استخدامها على النحو ضوابط السلبية) في حظر العازلة. التخفيفات لكل الأجسام المضادة يجب أن تكون مصممة وفقا تجريبيا في عيار الأضداد ، مستضد الضد التفاعل وفرة من البروتين في الخلية. النطاق المعتاد هو 1:50 إلى 1:600.
- إزالة الحجب العازلة التي تطلع وإضافة 1 مل / بئر الأضداد الأولية المخففة.
- احتضان عند درجة 30 ل1H.
- إزالة السائل بواسطة الشفط ، ويغسل ثلاث مرات الآبار مع برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد).
3. تصور leptospires
- إضافة 1 مل / بئر اليكسا فلور 488 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إما الماعز المضادة للأرنب مفتش أو الماعز المضادة للمفتش الماوس) المخفف 1:2000 والحمض النووي الفلورسنت وصمة عار ، 4'6 - diamidino - 2 - فينيل الأندول هيدروكلوريد ( دابي) المخفف إلى التركيز النهائي من 0.25 ميكروغرام / لتر في عرقلة العازلة. هذه الخطوة يضمن الكشف عن الأجسام المضادة وملزم بحضور جميع اللولبيات مستقلة عن الضد ملزمة ، على التوالي.
- احتضان الشرائح عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- إزالة السائل بواسطة الشفط ، ويغسل الآبار مرتين ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مع الماء المقطر (1 مل / جيد).
- الغرف وإزالة الشريط اللاصق من شرائح الزجاج والهواء الجاف عن 10 دقيقة ~.
- إضافة إطالة الذهب لمكافحة تصاعد تتلاشى المتوسطة (2 × 20 ميكرولتر لكل شريحة) وتغطي 24 × 50 مم زلة.
- يحضن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. هذه الخطوة كانت ضرورية للسماح متوسطة متزايدة لعلاج (تصلب).
- اغلاق الغطاء زلة مع طلاء الأظافر.
- تصور تلطيخ بواسطة المجهر مضان باستخدام سماوي / الزرقاء تصفية الكشف عن دابي وكشف الاخضر لتصفية فلور اليكسا 488. لضمان أن يتم تمثيل دقيق للعينات ، وتأكد من تقييم كامل للمنطقة الغرفة كل عينة.
- تسجيل البيانات عن طريق التصوير حقل ممثل عن كل عينة. عند التصوير اليكسا فلور 488 مضان ، استخدم نفس وقت التعرض لجميع العينات. وسوف تستخدم وقت التعرض متناسقة تسمح المقارنة أكثر دقة النتائج مع مستضدات اختبار مقابل الضوابط.
4. ممثل النتائج :
وترد أمثلة على النتائج مع الخلايا السطحية ايفا interrogans البريمية باستخدام أجسام مضادة ضد السطح وتحت السطح البروتينات في الشكل 2. ويعتبر الاختبار إيجابيا عندما تم الكشف عن مضان كبيرة في عينات مع leptospires سليمة لبروتين من الربا إن سطح مكشوف (الشكل 2A). عادة ، في اختبار ايجابية (هنا ، السطحية المعرضة للOmpL54) ، لوحظ كثافة مضان نفسها تقريبا في كل من خلايا سليمة وpermeabilized (الشكل 2A) ومن الضروري أن تشمل مراقبة سلبية على سلامة الغشاء الخارجي ، باستخدام أجسام مضادة ضد الجوفية ، محيط بالجبلة يفضل البروتين (مثل البريميات FlaA1 ، الشكل 2B). فقط عندما تظهر البيانات أن الغشاء الخارجي ظلت على حالها الدورينانوغرام التجربة ، أي الأجسام المضادة ضد بروتين تحت السطح لا تتفاعل لخلايا سليمة (لا مضان أو مضان أضعف بكثير بالمقارنة مع عينة permeabilized كما في الشكل 2B) ، يمكن استنتاج أن بروتين (ق) من الفائدة سطح مكشوف. ادراج تجارب ما قبل الأمصال المناعية (في حالة الأجسام المضادة النسائل المتعددة) ، والسيطرة على سلبية إضافية أمر ضروري للبيانات لا لبس فيها ، وينبغي ألا تسفر مضان كبيرة في خلايا سليمة أو permeabilized (الشكل 2A ، 2C). دابي وصمة عار لا بد من تصور leptospires عندما لاحظ نتائج سلبية (لا فلور اليكسا مضان 488). Counterstaining مع يوديد propidium هو بديل مقبول لدابي.
هذا الأسلوب هو نوعية أكثر منها كمية وأكثر إشراقا مضان قد يكون راجعا إلى سطح متعددة تتعرض الحواتم مستضدي يتم التعرف على مستضد واحد بالنسبة لمستضدات أخرى من وفرة على قدم المساواة ولكن مع الحواتم سطح أقل عرضة للخطر. ولذلك يمكن فقط كثافة مضان يمكن استخدامها لمقارنة تفاعل الأجسام المضادة للنفس ، مثل خلايا سليمة مقابل permeabilized وشدة لا مضان بين مختلف البروتينات. هذا التمييز مهم عندما يتم الحصول على نتيجة غامضة حيث لوحظ مضان أقل بكثير في خلايا سليمة من الخلايا في permeabilized (الشكل 2C). مثل هذه النتيجة تشير إلى أن البروتين هو إما في مكان شبه السطحية (مع بعض تلوين الخلفية غير محددة من خلايا سليمة) ، وأضداد ملزمة بشكل تفضيلي لغير الناطقين الحواتم التي يتم كشفها بعد permeabilization الميثانول أو البروتين قد يكون متعددة مواقع التوطين كما هو موضح لتخطيط موارد المؤسسات والبروتينات ELP أخرى ملتوية ، البورلية burgdorferi 14. في كلتا الحالتين ، وهي نتيجة التباس ايفا مثل هذا النهج يتطلب بديلة مثل biotinylation السطحية أو التحلل البروتيني السطح لتحديد ما إذا كان البروتين الفائدة على هذه السطحية المعرضة للأم لا 10.
مخطط تدفق الرقم 1. السطح للمقايسة المناعية مضان من اللولبيات interrogans البريمية. أولا ، يتم إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من الشرائح الغرفة بشكل جيد لمدة (اثنين على الأقل لكل الشرائح التجربة) والمحتضنة لleptospires التمسك به. المقبل ، يتم إصلاح leptospires على الشرائح غرفة بإضافة 1 مل / بئر بارافورمالدهيد 2 ٪ (PFA) للعينات مع الغشاء الخارجي سليمة (OM) و 1 مل / 100 بئر الميثانول ٪ الباردة للعينات مع OM permeabilized. المقبل ، يتم تحضين leptospires مع الاعتراف الأضداد السطحية المعرضة للبروتينات الأضداد جنبا إلى جنب مع الرقابة على البروتينات السطحية (الابتدائي وآب) حتى 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية التي الحضانة مع 1 مل / فلور جيدا الأضداد اليكسا 488 مترافق الثانوية. أخيرا ، الخلايا التي تصور المجهري مضان.
التحليل السطحي الرقم 2. المناعي للبروتينات البريميات. وقد بحث البريمية interrogans اللولبيات مع الأمصال المناعية وقبل المناعي ، وكانت النتائج السلبية المقترنة مع دابي ملون مباين لإثبات وجود اللولبيات. واستخدمت مخضر تصفية للكشف عن الأجسام المضادة اليكسا فلور 488 الثانوية المسمى ملزمة لسطح البروتينات المكشوفة وأزرق / سماوي مضان تصفية للكشف عن الحمض النووي ملزمة لدابي الخلية. أ) بحث مع الأضداد Leptospires الاعتراف بروتين سطح مكشوف ، OmpL54 10. ب) بحث مع خلايا أجسام مضادة ضد بروتين محيط بالجبلة الجوفية ، FlaA1 (مراقبة سلبية). C) بحث مع أجسام مضادة ضد خلايا porin البريميات ، OmpL1. تم الكشف عن ملزم الأمصال الأرانب إلى leptospires مع فلور اليكسا 488 شظايا الماعز مترافق مفتش الحكومة المضادة للأرنب. وتتخذ جميع الصور بعد التعرض ثانية 4 طويلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أسلوبنا ايفا سطح مماثلة لتلك التي تستخدم للتدليل على سطح التعرض borrelial مختلفة 15 و 16 و البريميات 12 و 17 من البروتينات. وصف تفاصيل السطح ايفا الأسلوب هنا صممت للحد من التلاعب في الخلايا وذلك في محاولة للحفاظ على سلامة الغشاء الخارجي مع الاستفادة من اتجاه الخلايا البريمية التمسك الشرائح الزجاجية. الأسلوب ينطوي على تركيز أقل (2 ٪ مقابل 4 ٪) من بارافورمالدهيد والغسيل الخارجي مع الأغشية العازلة استقرار (PBS +5 ملي MgCl 2) وعدد أقل من الخطوات غسل البروتوكولات نشرت سابقا 12 و 17. بالإضافة إلى ذلك ، اسلوبنا ايفا السطح تؤكد على أهمية الضوابط التي هي ضرورية لتفسير البيانات دقيقة. وجود قيود على الأسلوب هو أنه يتطلب توافر الأجسام المضادة المحددة التي هي قادرة على الاعتراف السطحية المعرضة للحاتمة (ق) من البروتين من الفائدة. في بعض الحالات ، يمكن عائق الفراغية من البروتينات السطحية أو منع lipopolysaccharides الضد مستضد التشكيل. ومع ذلك ، فإن الأسلوب ايفا السطحية هي تقنية بسيطة نسبيا لتقييم التعرض مباشرة من البروتينات السطحية ، ويمكن استخدامها إما بذاتها أو نهج بالتنسيق مع أساليب أخرى ، مثل وضع العلامات immunogold ، التحلل البروتيني السطح ، الخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل دائرة الصحة العامة منحة AI - 34431 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وزارة شؤون المحاربين القدامى صناديق البحوث الطبية (لداه).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
