Summary
leptospiral 단백질의 표면 노출을 평가하기위한 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 특별히 leptospiral 세포의 연약한 바깥 막의 중단을 방지하도록 설계되었습니다. 이 기술은 몇 가지 부정적인 컨트롤의 고용은 바깥 막과 항체 반응의 특이성의 무결성을 평가해야합니다.
Abstract
박테리아 표면 단백질은 호스트 세포와 직접 접촉과 환경 1 영양분의 이해에 관여하고 있습니다. 이러한 이유로, 세포 지방화는 박테리아 단백질의 기능 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 세균성 단백질의 표면 지방화는 pathogenicity의 메커니즘에 관련된 독성 요소의 식별 향한 중요한 단계입니다.
leptospiral 세포막의 2-5 fractionating위한 방법은 lipoproteins 대 transmembrane의 OMPs으로 바깥쪽 - 막 단백질 (OMPs)의 특정 클래스에 대한 선택 수 있으며, 따라서 misclassification 발생할 수 있습니다. 이 가능성은 구조적 차이가 어떻게 그들이 바깥 막으로 연결되어 있기 때문입니다. Lipoproteins은 N - 터미널 지질 잔기 (세명 지방산)과 지질 이중층의 phospholipids 6, 7 사이의 소수성 상호 작용을 통해 세포막과 연결되어 있습니다. 반면, transmembrane의 OMPs 일반적으로 배럴과 같은 구조 8, 9 배열 β - 시트 amphipathic에 의해 지질 이중층에 통합되어 있습니다. 또한, 바깥쪽 - 막의 단백질의 존재는 반드시 단백질 또는 도메인이 표면에 노출되는 것을 보장하지 않습니다. Spirochetal 외부 점막이 하위 표면 단백질의 세포와 포함의 부드러운 조작과 관련된 할거 그러므로 연약과 방법 것으로 알려져하는 것은 바깥 막의 무결성을 평가하기 위해 제어합니다.
여기, 우리는 직접적으로 손상 leptospires에 단백질의 표면 노출을 평가하기 위해 immunofluorescence 분석 (IFA) 메소드를 제시한다. 이 방법은 항원에 특정한 항체에 의해 leptospiral 표면 단백질의 인식을 기반으로합니다. 여기에, OmpL54 10 특정 항체는 기본, 표면 노출 epitopes에 aftero 바인딩 detetcted 있습니다. 손상 대 permeabilized 세포에 항체 반응의 비교는 단백질 leptospiral 표면에 선택적으로 존재 여부 세포 배포 평가를 가능하게합니다. 외부 막의 무결성이 선호 periplasm에있는 하나 이상의 표면 하의 단백질에 항체를 사용하여 평가해야합니다.
표면 IFA 방법은 특정 항체가 사용할 수있는 어떤 leptospiral 단백질의 표면 노출을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 방법의 유용 성과 한계는 모두 사용된 항체가 기본 epitopes에 바인딩할 수 있는지 여부에 따라 달라집니다. 항체가 자주 재조합 단백질, 기본, 표면 노출 단백질의 epitopes에 대한 사육되기 때문에 인정되지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 표면 IFA 방법은 그대로 세균 표면의 구성 요소를 공부를위한 유용한 도구입니다. 이 방법은 leptospires뿐만 아니라 다른 spirochetes 및 그람 음성 세균에 대해뿐만 아니라 적용할 수 있습니다. OMPs의 표면 노출에 대한 강한 결론에 대한 여러 셀 로컬 라이제이션 방법을 포함한 종합적인 접근 방식은 10 권장합니다.
Protocol
1. 유리 슬라이드에 Leptospira의 고정
- Leptospira interrogans는 클래스 BSL2 병원체이다. 라이브 전지 작업은 같은 장갑을 끼고, 실험실 - 코팅 및 살균 - 모자 pipetting 단계로 적절한 처리가 필요합니다.
- 30 ° C 그들이 도달할 때까지 중순에 약 6 일 늦은 로그 단계 (5 X 10 8 셀 / ML 5 × 10 7 밀도). 1 %의 토끼 혈청과 보충, EMJH medium11에서 Leptospira 그로
- 상온에서 7 분 ~ 2000 XG에서 원심 분리하여 문화를 수확.
- 흡인에 의해 표면에 뜨는를 제거하고 부드럽게 인산염의 펠렛을 resuspend 5 X 10 8 셀 / ML의 최종 농도 호수 (PBS) -5 MM에게 MgCl 2, pH7.2를 버퍼.
- 두 잘 챔버 유리 슬라이드의 각 웰에 세포 현탁액 1 ML을 추가하고 30 품어 ° C를 80 분에 대한 세포를 준수하도록합니다.
- 조심스럽게 흡인하여 언바운드 세포가 들어있는 액체를 제거합니다.
- / 잘 PBS - 5 MM MgCl 2 2 % paraformaldehyde 1 ML 추가하여 유리 슬라이드에 남아있는 그대로 박테리아를 수정. 30 40 분 품어 ° C. 이러한 슬라이드 표면 단백질의 노출 평가를위한 것입니다.
- 하위 표면 단백질을 평가 제어 슬라이드에, 얼음처럼 차가운 메탄올 1 ML / 물론 100 %로 고정하여 외부 막을 permeabilize. 20 분 -20 ° C에서 알을 품다. 메탄올은 여러 가지 방법으로 행동 : 그것은 외부 막을 permeabilizes 단백질 denaturates하고, 유리 슬라이드에 수정 세포.
- 열망의 요원을 고정 제거합니다.
2. 특정 항체와 라벨링
- / 잘 차단 버퍼 (Difco Leptospira 농축 EMJH) 1 ML 추가하여 불특정 바인딩을 차단합니다. 90 분 30 ° C에서 알을 품다.
- 특정 항체 (면역 토끼 세라 드나 마우스 단클론 항체, OmpL54 10 특정 여기 polyclonal 토끼 세라, FlaA1 12, 및 OmpL1 13)과 아무런 항체를 포함하지 미리 면역 토끼 세라이나 마우스 고행 유체 (부정적인 컨트롤로 활용시)에 희석 버퍼를 차단. 각 항체에 대한 Dilutions는 경험적으로 세포에 항원 - 항체 반응과 단백질의 풍부한, 항체 titer에 따라 결정해야합니다. 일반적인 범위는 1:600으로 1시 50분입니다.
- 흡인에 의해 차단 버퍼를 제거하고 1 ML / 음의 희석 차 항체를 추가합니다.
- 1 시간 30 ° C에서 알을 품다.
- 흡인하여 액체를 제거하고 PBS (1 ML / 음)와 우물을 세 번 씻으십시오.
3. leptospires의 시각화
- 1 ML / 음의 알렉사 희석 플루어 488 - 라벨 보조 항체 (염소 안티 - 토끼 IgG 또는 염소 방지 마우스 IgG)를 1:2000 및 형광 핵산 얼룩, 4'6 - diamidino - 2 - 페닐 - 인돌 dihydrochloride을 (추가 DAPI)는 0.25 μg / 버퍼를 차단에 ML의 최종 농도로 희석. 이 단계는 항체 바인딩 및 바인딩, 각각 항체의 독립 모든 spirochetes의 존재의 확인을 보장합니다.
- ° C 45 분 30에 슬라이드를 품어.
- 흡인하여 액체를 제거하고 증류수 (1 ML / 음)로 두 번 PBS와 한 우물을 씻으십시오.
- 실과 유리 슬라이드와 ~ 10 분 건조 공기의 접착 스트립을 제거합니다.
- 골드 방지 퇴색 설치 매체 (슬라이드 당 20 μl 2 X)과 24 X 50mm 커버 슬립을 연장 추가합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 품어. 이 단계는 설치 매체 (강화) 치료하도록하는 것이 필요합니다.
- 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄.
- DAPI에 대한 시안 / 블루 감지 필터와 알렉사 플루어 488에 녹색 검색 필터를 사용하여 형광 현미경으로 얼룩을 시각화. 샘플의 정확한 표현이 만들어되었는지 확인하려면 각 샘플에 대한 전체 챔버 영역을 평가할 수 있는지 확인하십시오.
- 이미징 각 샘플에 대한 대표적인 필드로 데이터를 기록합니다. 이미지 알렉사 플루어 488 형광이 모든 샘플에 대해 같은 노출 시간을 사용하면. 일관된 노출 시간을 사용하면 테스트 항원 대 컨트롤과 함께 결과를보다 정확한 비교를하실 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
표면 및 하위 표면 단백질에 대한 항체를 사용하여 Leptospira interrogans 세포와 표면 IFA 결과의 예는 그림 2에 표시됩니다. 실질적인 형광이 표면 (그림 2A) 노출 관심 단백질에 대한 손상 leptospires과 샘플에 감지되면 시험은 긍정적인 것으로 간주됩니다. 보통 긍정적인 검사 (여기 OmpL54을 표면 노출)에, 약 같은 형광 강도는 그것은 표면 하의에 대한 항체를 사용하여 바깥쪽 - 멤브레인 무결성에 대한 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 필수적입니다 (그림 2A) 온전하고 permeabilized 모두 세포에서 관찰됩니다 선호 periplasmic 단백질 (예 : leptospiral FlaA1, 그림. 2B). 데이터는 외부 세포막이 손상 듀리 유지했음을 표시하는 경우에만NG 실험, 하위 표면 단백질에 대한 즉, 항체가 그대로 세포 (그림에서와 같이 permeabilized 샘플에 비해 형광 또는 훨씬 약한 형광 안돼. 2B)에 반응하지 그것은 관심의 단백질 (S)가 있다고 결론을 내렸다 수 있습니다 표면은 노출. 추가 부정적인 제어로 사전에 면역 세라 (polyclonal 항체의 경우)와 실험의 포함은 모호하지 않은 데이터를 위해 필수적이며, 그대로 또는 permeabilized 세포 (그림 2A, 2C)에 상당한 형광를 얻을 수 없습니다. 얼룩 DAPI은 부정적인 결과가 (NO 알렉사 플루어 488 형광) 관찰 때 leptospires을 시각화하는 것이 필요합니다. propidium 요오드화물의와 Counterstaining 것은 DAPI에 수용 대안입니다.
이 방법은 같은 풍요의 다른 항원에 비해 하나의 항원에 있지만 적은 표면에 노출된 epitopes로 인정되고 antigenic epitopes를 노출의 여러 표면으로 인해 발생했을 수 있습니다 질적보다는 밝은 형광으로 양적됩니다. 따라서 형광 강도는 등 서로 다른 단백질 간의 손상 대 permeabilized 세포 형광하지 농도와 같은 항체의 반응을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 구별은 훨씬 적은 형광이 permeabilized 세포 (그림 2C)에 비해 그대로 세포에서 관찰 어디에 모호한 결과를 얻을 때 중요하다. 이러한 결과 중 단백질 (그대로 세포의 일부가 아닌 구체적인 배경 얼룩 포함) 하위 표면 위치에 있음을 나타냅니다, 항체는 여러 수도 우선적으로 메탄올의 permeabilization 또는 단백질 후 노출이 아닌 기본 epitopes에 구속력이 지역화 사이트 같은 다른 spirochete, Borrelia burgdorferi 14 ERP 및 ELP 단백질에 대해 설명했다. 각각의 경우에, 이와 같은 모호한 IFA 결과가 관심의 단백질 표면 노출 여부 10 여부를 확인하는 등 표면 biotinylation 또는 표면 proteolysis로 대체 접근이 필요합니다.
Leptospira interrogans spirochetes의 단백질 형광 분석 표면에 대해 그림 1. 플로우 차트. 첫째, 세포 현탁액 1 ML은 두 잘 챔버 슬라이드의 각 잘 추가 (각 실험에 대해 적어도 두 개의 슬라이드)와 준수 leptospires위한 incubated입니다. 다음 leptospires 그대로 외부 멤브레인 (OM)와 permeabilized OM과 샘플 1 ML / 물론 100 % 차가운 메탄올과 샘플 / 음 2 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML 추가하여 챔버 슬라이드에 고정됩니다. 다음 leptospires 30에서 표면 하의 단백질 (주 AB의) · 90 분 C에 대한 제어 항체와 함께 표면 노출 단백질을 인식 항체와 incubated 있습니다. 그런 다음, 기본 항체는 / 잘 알렉사 플루어 488 복합 이차 항체 1 ML과 부화에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 세포는 형광 현미경에 의해 시각입니다.
leptospiral 단백질의 그림 2. immunofluorescence 표면 분석. Leptospira interrogans spirochetes는 면역 및 Pre - 면역 세라와 읽혔어요하고, 부정적인 결과는 spirochetes의 존재를 입증하는 DAPI counterstain와 결합했다. 녹색 형광 필터는 알렉사 플루어 세포 DNA에 바인딩 DAPI를 검색에 노출 단백질 및 파랑 / 시안 형광 필터를 표면에 바인딩 488 레이블 차 항체를 감지하는 데 사용되었다. A) Leptospires는 표면에 노출된 단백질 OmpL54 10 인식 항체와 탐지. B) 세포는 periplasmic 표면 하의 단백질, FlaA1 (대조군)에 대한 항체와 탐지. C) 세포 leptospiral porin, OmpL1에 대한 항체와 탐지. leptospires에 토끼 세라의 바인딩은 알렉사 플루어 488 복합 염소 안티 - 토끼 IgG의 파편 발견했다. 모든 이미지는 4 초 동안 노출 후 촬영됩니다.
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Discussion
우리의 표면 IFA 기술은 다양한 borrelial 15, 16 leptospiral 12, 17 단백질의 표면 노출을 증명하기 위해 사용하는 것과 비슷합니다. 표면 IFA 방법의 내용은 유리 슬라이드에 충실하기 위해 Leptospira 세포의 경향을 활용하면서 외부 멤브레인 무결성을 유지하기 위해 세포의 조작을 최소화하기 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 이 메서드는 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜 12, 17보다 바깥쪽 - 막 안정화 버퍼 (PBS 5 MM MgCl 2) 적은 세척 단계를 씻는 paraformaldehyde의 낮은 농도 (4 % 대 2 %)이 포함됩니다. 또한, 우리의 표면 IFA 방법은 정확한 데이터 해석을위한 필수적인 조절의 중요성을 강조하고 있습니다. 방법의 한계는 관심의 단백질의 에피토프 (들)을 표면 노출 인식 능력이 특정 항체의 가용성을 필요로한다는 것입니다. 어떤 경우에는, 다른 표면 단백질이나 lipopolysaccharides하여 steric 방해는 항체 - 항원의 형성을 방지할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 표면 IFA 방법은 직접적으로 단백질의 표면 노출을 평가하기위한 비교적 간단한 기술이며 독립형 방식으로 또는 immunogold 라벨, 표면 proteolysis 등의 다른 기술과 함께 콘서트도 사용할 수 있습니다
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 보건 서비스 교부금에 의해 지원되었다 AI - 34431 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서와 VA 메디컬 연구 기금 (DAH로)로 (DAH)을.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
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