Summary
Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.
Abstract
La superficie de las proteínas bacterianas están involucradas en contacto directo con las células huésped y en la absorción de nutrientes del medio ambiente 1. Por esta razón, la localización celular puede ayudar a comprender el papel funcional de las proteínas bacterianas. Localización de la superficie de las proteínas bacterianas es un paso clave hacia la identificación de factores de virulencia que participan en los mecanismos de patogenicidad.
Métodos de fraccionamiento 2.5 membranas leptospira puede ser selectiva para una cierta clase de proteínas de la membrana externa (OMP), como las lipoproteínas vs OMPs transmembrana, y por lo tanto, llevar a errores de clasificación. Esto probablemente es debido a las diferencias estructurales y la forma en que están asociados a la membrana externa. Las lipoproteínas se asocia con membranas a través de una interacción hidrofóbica entre la fracción lipídica N-terminal (tres ácidos grasos) y los fosfolípidos bicapa lipídica 6, 7. Por el contrario, OMPs transmembrana suelen estar integrados en la bicapa lipídica por anfipáticas β-hojas dispuestas en una estructura de barril-como 8, 9. Además, la presencia de una proteína en la membrana externa, no garantiza necesariamente que la proteína o sus dominios están expuestos en la superficie. Espiroquetas membranas externas se sabe que son métodos frágil y por tanto, requiere la participación manipulación suave de las células y la inclusión de proteínas de sub-superficie de control para evaluar la integridad de la membrana externa.
A continuación, presentamos un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para evaluar directamente la exposición de la superficie de las proteínas en las leptospiras intacto. Este método se basa en el reconocimiento de proteínas de la superficie de leptospiras por el antígeno de anticuerpos específicos. En esto, los anticuerpos específicos para OmpL54 10 son detetcted aftero vinculante a los nativos epítopos de la superficie, expuestos. Comparación de la reactividad de anticuerpos frente a células intactas permeabilized permite la evaluación de la distribución de celulares y si una proteína está presente en la superficie de forma selectiva leptospirosis. La integridad de la membrana externa deben ser evaluados utilizando anticuerpos contra una o más proteínas del subsuelo, preferentemente en el periplasma.
El método de la superficie de la IFA se puede utilizar para analizar la exposición de la superficie de cualquier proteína de leptospira a que los anticuerpos específicos disponibles. Tanto la utilidad y las limitaciones del método depende de si los anticuerpos empleados son capaces de unirse a epítopos nativos. Dado que los anticuerpos a menudo se levantan contra las proteínas recombinantes, los epítopos de los nativos, expuestas en la superficie las proteínas no pueden ser reconocidos. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una herramienta valiosa para el estudio de los componentes de la superficie bacteriana intacta. Este método se puede aplicar no sólo para las leptospiras, pero también otras espiroquetas y bacterias gram-negativas. Para conclusiones más sólidas sobre la superficie de exposición de OMP, un enfoque integral que implique a varios métodos de localización celular se recomienda 10.
Protocol
1. La fijación de Leptospira a las diapositivas de cristal
- Leptospira interrogans es una clase BSL2 patógeno. Trabajar con células vivas que requiere un manejo adecuado, como guantes, bata de laboratorio y medidas de pipeteo en una campana estéril.
- Crecer Leptospira en EMJH medium11, complementada con suero de conejo al 1% a 30 ° C hasta llegar a mediados o finales de la fase de inicio de sesión (la densidad de 5 x 10 7 5 x 10 8 células / ml) durante aproximadamente 6 días.
- La cosecha del cultivo por centrifugación a 2000 xg durante ~ 7 minutos a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante por aspiración y suavemente resuspender el precipitado en tampón fosfato salino (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7.2 a una concentración final de 5 x 10 8 células / ml.
- Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pocillo de dos y la cámara de diapositivas de vidrio y se incuba a 30 ° C durante 80 minutos para permitir que las células se adhieran.
- Retire con cuidado el líquido que contiene las células no unidas por la aspiración.
- Fix restantes bacterias intactas a portaobjetos de vidrio mediante la adición de 1 ml / pocillo de 2% de paraformaldehído en PBS-5 de MgCl 2 mM. Incubar durante 40 min a 30 ° C. Estas diapositivas serán para la evaluación de la superficie expuesta proteínas.
- Para evaluar el control de diapositivas bajo la superficie las proteínas, permeabilizar la membrana externa mediante la fijación de 1 ml / pocillo de 100% helado de metanol. Se incuba a 20 ° C durante 20 min. El metanol actúa de varias maneras: permeabilizes la membrana externa, denaturates las proteínas y las células correcciones a las diapositivas de cristal.
- Eliminar la fijación de los agentes por aspiración.
2. Etiquetado con anticuerpos específicos
- Bloquear la unión no específica mediante la adición de 1 ml / pocillo de tampón de bloqueo (Difco Leptospira enriquecimiento EMJH). Se incuba a 30 ° C durante 90 min.
- Diluir el anticuerpo específico (sueros de conejo inmune o los anticuerpos monoclonales de ratón, el suero de conejo aquí policlonales específicos para OmpL54 10, FlaA1 12 y 13 OmpL1) y pre-inmune de conejo líquido ascético sueros o un ratón que no contiene anticuerpos (cuando se utiliza como controles negativos) en tampón de bloqueo. Diluciones para cada anticuerpo tiene que ser determinada empíricamente en función de análisis de anticuerpos, antígeno-anticuerpo reactividad y la abundancia de proteínas en la célula. El rango normal es de 1:50 a 1:600.
- Retire el amortiguador de bloqueo por aspiración y se añade 1 ml / pocillo de anticuerpos primarios diluidos.
- Se incuba a 30 ° C durante 1 hora.
- Eliminar el líquido mediante la aspiración y lavar los pocillos tres veces con PBS (1 ml / pocillo).
3. Visualización de las leptospiras
- Añadir 1 ml / pocillo de Alexa Fluor 488-anticuerpos secundarios marcados (ya sea de cabra anti-IgG de conejo o cabra anti-ratón IgG) diluido 1:2000 y el ácido nucleico mancha fluorescente, 4'6-diamidino-2-fenil-indol dihidrocloruro ( DAPI) diluido a una concentración final de 0,25 mg / ml en tampón de bloqueo. Este paso asegura la detección de la unión de los anticuerpos y la presencia de todas las espiroquetas independiente de la unión de los anticuerpos, respectivamente.
- Incubar los portaobjetos a 30 ° C durante 45 min.
- Eliminar el líquido mediante la aspiración y lavar los pocillos dos veces con PBS y una vez con agua destilada (1 ml / pocillo).
- Quitar las cámaras y la cinta adhesiva del portaobjetos de vidrio y el aire seco de aproximadamente 10 min.
- Añadir prolongar Oro anti-fade medio de montaje (2 x 20 l por diapositiva) y un 24 x 50 mm cubierta antideslizante.
- Incubar toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Este paso es necesario para permitir que el medio de montaje para curar (endurecer).
- Sellar la hoja de la cubierta con esmalte de uñas.
- Visualizar las manchas por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro de detección cian / azul para DAPI y un filtro verde para la detección de Alexa Fluor 488. Para asegurarse de que una representación exacta de las muestras se hace, asegúrese de evaluar el área de la cámara por completo para cada muestra.
- Registrar los datos de un campo de imágenes representativas de cada muestra. Cuando la imagen Alexa Fluor 488 de fluorescencia, utilice el mismo tiempo de exposición para todas las muestras. El uso de un tiempo de exposición constante permitirá una comparación más precisa de los resultados con los antígenos de prueba frente a los controles.
4. Los resultados representativos:
Ejemplos de los resultados de la superficie de IFA con Leptospira interrogans células utilizando anticuerpos contra la superficie y del subsuelo, las proteínas se muestran en la Figura 2. Una prueba se considera positiva cuando se detecta fluorescencia claramente en las muestras con leptospiras intacto para una proteína de interés que es la superficie expuesta (Figura 2A). Por lo general, un resultado positivo (en este caso, la superficie expuesta OmpL54), la intensidad de fluorescencia aproximadamente el mismo que se observa tanto en las células intactas y permeabilized (Fig. 2A) Es imprescindible incluir un control negativo para la integridad de la membrana externa, el uso de anticuerpos contra un subsuelo , preferiblemente periplasmic proteínas (por ejemplo, la leptospirosis FlaA1, fig. 2B). Sólo cuando los datos muestran que la membrana externa se ha mantenido intacta during el experimento, es decir, anticuerpos contra una proteína de sub-superficie no reaccionan a las células intactas (no fluorescencia o fluorescencia mucho más débil si se compara con la muestra permeabilized como en la fig. 2B), se puede concluir que la proteína (s) de interés superficie expuesta. La inclusión de los experimentos con suero pre-inmune (en el caso de anticuerpos policlonales) como control negativo adicional es esencial para los datos sin ambigüedades y no deben producir fluorescencia claramente en las células intactas o permeabilized (Fig. 2A, 2C). Tinción DAPI es necesario visualizar leptospiras cuando los resultados negativos (no Alexa Fluor 488 fluorescencia) se observan. Contratinción con yoduro de propidio es una alternativa aceptable a la DAPI.
Este método es más cualitativa que cuantitativa, como la fluorescencia más brillante puede ser debida a la superficie expuesta múltiples epítopos antigénicos de ser reconocido en un solo antígeno en relación con otros antígenos de igual abundancia, pero con menos superficie expuesta epítopos. Por lo tanto la intensidad de fluorescencia sólo puede ser utilizado para comparar la reactividad de los mismos anticuerpos, tales como las células intactas frente permeabilized y la intensidad de fluorescencia no entre diferentes proteínas. Esta distinción es importante cuando un resultado ambiguo que se obtiene de fluorescencia mucho menos se observa en las células intactas que en las células permeabilizadas (Fig. 2C). Tal resultado indica que, o bien la proteína está en un lugar debajo de la superficie (con algunas manchas de fondo no específico de las células intactas), los anticuerpos son vinculantes preferentemente a los no nativos epítopos que son expuestos después de la permeabilización de metanol o una proteína puede tener múltiples sitios de localización como se describe para Erp y elp proteínas de otra espiroqueta, Borrelia burgdorferi 14. En cualquier caso, un resultado ambiguo IFA de este tipo requiere de enfoques alternativos, tales como biotinilación superficie o proteólisis de superficie para determinar si la proteína de interés es la superficie expuesta o no 10.
Figura 1. Diagrama de flujo para la superficie de ensayo de inmunofluorescencia de Leptospira interrogans espiroquetas. En primer lugar, 1 ml de suspensión celular se añade a cada pocillo de la cámara de diapositivas de dos así (al menos dos láminas para cada experimento) y se incubó durante las leptospiras a que se adhieran. A continuación, las leptospiras se fijan a la cámara de diapositivas mediante la adición de 1 ml / pocillo de 2% de paraformaldehído (PFA) para las muestras con membrana intacta externa (OM) y 1 ml / pocillo de 100% de metanol frío para muestras con permeabilized OM. A continuación, las leptospiras son incubadas con anticuerpos que reconocen proteínas de superficie expuesta, junto con el control de anticuerpos para las proteínas del subsuelo (Primaria AB) a 30 ° C durante 90 min. A continuación, los anticuerpos primarios se detectan mediante la incubación con 1 ml / pocillo de Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios conjugados. Finalmente, las células se visualizan por microscopía de fluorescencia.
Figura 2. Superficie inmunofluorescencia análisis de las proteínas de leptospirosis. Leptospira interrogans espiroquetas se probaron con sueros inmunes y pre-inmune, y los resultados negativos se combina con una contratinción DAPI para demostrar la presencia de espiroquetas. Un filtro verde fluorescencia se utilizan para detectar Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario marcado la unión a las proteínas de la superficie expuesta y azul / cian filtro de fluorescencia para detectar la unión al ADN de células DAPI. A) Las leptospiras probaron con anticuerpos que reconocen una proteína de superficie expuesta, OmpL54 10. B) Las células probaron con anticuerpos contra una proteína periplasmic subsuelo, FlaA1 (control negativo). C) Las células probaron con anticuerpos contra la leptospira porina, OmpL1. La unión de suero de conejo a las leptospiras se detectaron con Alexa Fluor 488 conjugado de cabra anti-conejo IgG fragmentos. Todas las imágenes son tomadas después de 4 segundos de exposición largo.
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Discussion
La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial 15, 16 y leptospirosis 12, 17 proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método consiste en una concentración más baja (2% frente al 4%) de paraformaldehído, lavado con tampón estabilizadora de membrana externa (PBS 5 mM MgCl 2) y menos pasos de lavado que se había publicado protocolos 12, 17. Además, la superficie de nuestro método de IFA pone de relieve la importancia de los controles que son esenciales para la interpretación de los datos precisos. Una limitación de este método es que requiere de la disponibilidad de anticuerpos específicos que son capaces de reconocer la superficie expuesta al epítopo (s) de la proteína de interés. En algunos casos, el impedimento estérico por otras proteínas de la superficie o lipopolisacáridos pueden prevenir la formación de antígeno-anticuerpo. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una técnica relativamente sencilla para la evaluación directa de exposición de la superficie de las proteínas y puede ser utilizado como un solo enfoque o en combinación con otras técnicas, tales como inmuno-etiquetado, la proteólisis de la superficie, etc
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de subvención AI-34 431 (a DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y VA Fondos de Investigación Médica (a DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
