Summary
Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.
Abstract
Bakterielle Oberflächenproteine in direktem Kontakt mit Wirtszellen und in Aufnahme von Nährstoffen aus der Umwelt 1 beteiligt. Aus diesem Grund können zelluläre Lokalisation Einblicke in die funktionelle Rolle der bakteriellen Proteine liefern. Oberflächen-Lokalisation von bakteriellen Proteinen ist ein wichtiger Schritt in Richtung Identifizierung von Virulenzfaktoren in Mechanismen der Pathogenität beteiligt.
Verfahren zur Fraktionierung von Leptospira-Membranen Mai 02 bis 05 werden selektiv für eine bestimmte Klasse von äußeren Membranproteinen (OMPs), wie Lipoproteine vs transmembrane OMPs und damit zu Fehlklassifikation führen. Dies dürfte sich aufgrund der strukturellen Unterschiede und wie sie sich an die äußere Membran verbunden. Lipoproteine sind mit Membranen über eine hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den N-terminale Lipid-Einheit (drei Fettsäuren) und der Lipid-Doppelschicht Phospholipide 6, 7 verbunden sind. Im Gegensatz dazu sind transmembrane OMPs typischerweise in die Lipid-Doppelschicht von amphipathischen β-Blätter in einem Fass-ähnliche Struktur 8, 9 angeordnet integriert. Darüber hinaus bedeutet Anwesenheit eines Proteins in der äußeren Membran nicht unbedingt gewährleistet, dass das Protein oder seine Domänen auf der Oberfläche ausgesetzt sind. Spirochäten äußeren Membranen sind dafür bekannt, fragil und erfordern daher Methoden, bei denen sanfte Manipulation von Zellen und die Einbeziehung von Sub-Surface-Protein kontrolliert, um die Integrität der äußeren Membran zu beurteilen.
Hier präsentieren wir ein Immunfluoreszenztest (IFA)-Methode, um direkt zu bewerten Oberfläche Exposition von Proteinen auf intakten Leptospiren. Diese Methode beruht auf der Anerkennung von Leptospira-Oberflächenproteine von Antigen-spezifischen Antikörpern. Hierbei werden Antikörper, die spezifisch für OmpL54 10 detetcted aftero Bindung an native, ausgesetzte Oberfläche Epitope. Vergleich der Antikörper-Reaktivität auf intakte gegenüber permeabilisierten Zellen ermöglicht die Evaluierung der zellulären Verteilung und ob ein Protein selektiv präsentieren auf Leptospira-Oberfläche ist. Die Integrität der äußeren Membran sollten anhand Antikörper gegen ein oder mehrere unterirdische Proteine, vorzugsweise im Periplasma lokalisiert werden.
Die Oberfläche IFA-Methode kann verwendet werden, um Oberflächen Exposition von Leptospira-Protein, an das spezifische Antikörper zur Verfügung zu analysieren. Sowohl die Nützlichkeit und die Einschränkung des Verfahrens hängt davon ab, ob die eingesetzten Antikörper sind in der Lage, auf native Epitope binden. Da Antikörper oft gegen rekombinante Proteine, Epitope des nativen, Oberflächen-exponierten Proteine ausgelöst werden, darf nicht angesetzt werden. Dennoch ist die Oberfläche IFA-Methode zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung Komponenten des intakten Bakterien Oberflächen. Diese Methode kann nicht nur für Leptospiren, aber auch andere Spirochäten und Gram-negativen Bakterien angewendet werden. Für eine stärkere Rückschlüsse auf Oberflächen-Exposition von OMPs, ist ein umfassender Ansatz mit mehreren Zell-Lokalisation Methoden 10 empfohlen.
Protocol
1. Fixation von Leptospira auf Glasplättchen
- Leptospira interrogans ist eine Klasse BSL2 Erregers. Arbeiten mit lebenden Zellen erfordert angemessene Behandlung, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, Labor-Mantel und Pipettierschritte in einem sterilen-Haube.
- Wachsen Leptospira in EMJH medium11, ergänzt mit 1% Kaninchenserum bei 30 ° C bis sie Mitte bis Ende der Log-Phase (Dichte von 5 x 07 bis 5 Oktober x 10 8 Zellen / ml) für ca. 6 Tage.
- Ernte der Kultur durch Zentrifugation bei ~ 2000 xg für 7 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und sanft das Pellet in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 zu einer Endkonzentration von 5 x 10 8 Zellen / ml.
- 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-well Kammer Glasträger und Inkubieren bei 30 ° C für 80 min, damit Zellen zu haften.
- Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit ungebundenen Zellen durch Aspiration.
- Fix intakten Bakterien Glasträger durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd in PBS-5 mM MgCl 2. Inkubieren für 40 min bei 30 ° C. Diese Folien werden für die Beurteilung der Oberflächen-exponierten Proteine.
- Für die Steuerung Dias Beurteilung sub-Oberflächenproteine, permeabilisieren die äußere Membran durch Fixierung mit 1 ml / well aus 100% eiskaltem Methanol. Inkubation bei -20 ° C für 20 min. Methanol wirkt in mehrfacher Hinsicht: es permeabilizes der äußeren Membran, die Proteine denaturiert und fixiert Zellen auf Glasplättchen.
- Entfernen Fixiermittel durch Aspiration.
2. Die Markierung mit spezifischen Antikörpern
- Block nicht-spezifische Bindung durch Zugabe von 1 ml / Vertiefung Blocking-Puffer (Difco Leptospira Enrichment EMJH). Inkubation bei 30 ° C für 90 min.
- Verdünnen Sie die spezifischen Antikörper (Immun Kaninchenseren oder monoklonalen Maus-Antikörper, hier polyklonalen Kaninchen-Seren spezifisch für OmpL54 10, FlaA1 12 und OmpL1 13) und pre-immune Kaninchenseren oder Maus asketischen Flüssigkeit, die keine Antikörper (wenn sie als negative Kontrollen verwendet) in Blockierungspuffer. Verdünnungen für jeden Antikörper müssen empirisch ermittelt je nach Antikörper-Titer, Antigen-Antikörper-Reaktivität und Fülle des Proteins in der Zelle. Die übliche Strecke ist 1:50 bis 1:600.
- Entfernen Sie die Blocking-Puffer durch Absaugen und Zugabe von 1 ml / well des verdünnten primären Antikörper.
- Inkubation bei 30 ° C für 1h.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Vertiefungen dreimal mit PBS (1 ml / well).
3. Visualisierung von Leptospiren
- 1 ml / well des Alexa Fluor 488-markierten sekundären Antikörper (entweder Ziege Anti-Kaninchen-IgG oder Ziege anti-Maus IgG) verdünnt 1:2000 und fluoreszierende Nukleinsäure Fleck, 4'6-diamidino-2-phenyl-indol dihydrochlorid ( DAPI), um eine endgültige Konzentration von 0,25 g / ml in Blocking-Puffer verdünnt. Dieser Schritt stellt sicher Detektion von Antikörper-Bindung und die Anwesenheit aller Spirochäten unabhängig von Antikörper-Bindung, bzw..
- Inkubieren Sie die Objektträger bei 30 ° C für 45 min.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Wells zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser (1 ml / well).
- Entfernen Sie die Kammern und die Klebestreifen von den Glasplatten und an der Luft trocknen für ~ 10 min.
- Add ProLong Gold-anti-fade Eindeckmedium (2 x 20 ul pro Folie) und einem 24 x 50 mm Deckglas.
- Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieser Schritt ist notwendig, damit die Montage Medium zu heilen (verhärten).
- Seal das Deckglas mit Nagellack.
- Visualisieren Sie die Färbung mittels Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem cyan / blau-Erkennung Filter für DAPI und einem grünen Filter zur Erkennung von für Alexa Fluor 488. Um sicherzustellen, dass eine genaue Darstellung der Proben vorgenommen wird, stellen Sie sicher, bewerten die gesamte Kammer-Bereich für jede Probe.
- Notieren Sie die Daten durch bildgebende einer repräsentativen Bereich für jede Probe. Bei der Abbildung Alexa Fluor 488 Fluoreszenz, die gleiche Belichtungszeit für alle Proben. Mit einer konsequenten Belichtungszeit erlaubt genaueren Vergleich der Ergebnisse mit Testantigene Vergleich zu den Kontrollen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Beispiele für oberflächenaktive IFA Ergebnisse mit Leptospira interrogans Zellen mit Antikörpern gegen Oberfläche und Untergrund-Proteine sind in Abbildung 2 dargestellt. Ein Test gilt als positiv, wenn wesentliche Fluoreszenz in den Proben mit intakten Leptospiren für ein Protein von Interesse, dass Oberfläche ausgesetzt ist (Abb. 2A) erkannt. Üblicherweise wird bei einem positiven Test (hier OmpL54 Oberfläche exponiert), ist ungefähr dieselbe Fluoreszenzintensität in beiden intakten und permeabilisierten Zellen beobachtet werden (Abb. 2A) Es ist wichtig, eine negative Kontrolle für die äußere Membran Integrität mit Hilfe von Antikörpern gegen einen Untergrund sind , vorzugsweise periplasmatischen Proteins (z. B. Leptospira FlaA1, Abb.. 2B). Nur wenn die Daten zeigen, dass die äußere Membran ist intakt geblieben During des Experiments, dh Antikörper gegen ein sub-Oberflächenprotein nicht an intakte Zellen (keine Fluoreszenz oder viel schwächere Fluoreszenz, wenn sie permeabilisierten Probe wie in Abb. verglichen. 2B) zu reagieren, kann gefolgert werden, dass das Protein (e) von Interesse ist Oberfläche. Einbeziehung von Experimenten mit Prä-Immunseren (im Falle der polyklonale Antikörper) als zusätzliche negative Kontrolle ist unerlässlich zur eindeutigen Daten und sollten nicht nachgeben erhebliche Fluoreszenz in intakten oder permeabilisierten Zellen (Abb. 2A, 2C). DAPI-Färbung ist notwendig, um Leptospiren visualisieren, wenn negative Ergebnisse (keine Alexa Fluor 488 Fluoreszenz) beobachtet werden. Gegenfärbung mit Propidiumiodid ist eine akzeptable Alternative zu DAPI.
Diese Methode ist eher qualitative als quantitative als hellere Fluoreszenz kann auf mehrere ausgesetzte Oberfläche antigene Epitope in einem einzigen Antigen im Vergleich zu anderen Antigenen gleicher Fülle, aber mit weniger exponiert Epitope erkannt. Deshalb ist die Fluoreszenz-Intensitäten können nur verwendet werden, um die Reaktivität des gleichen Antikörper, wie intakt gegenüber permeabilisierten Zellen und nicht Fluoreszenzintensitäten zwischen verschiedenen Proteinen zu vergleichen. Diese Unterscheidung ist wichtig, wenn ein zwiespältiges Ergebnis erzielt wird, wo deutlich weniger Fluoreszenz in intakten Zellen als in permeabilisierten Zellen (Abb. 2C) beobachtet. Ein solches Ergebnis deutet darauf hin, dass entweder das Protein in einer Sub-Surface-Standort ist (mit einigen nicht-spezifische Hintergrundfärbung von intakten Zellen), sind die Antikörper binden vorzugsweise an nicht-native Epitope, die nach Methanol Permeabilisierung oder ein Protein ausgesetzt sind möglicherweise mehrere Lokalisierung Websites für Erp und Elp Proteine eines anderen Spirochäten, Borrelia burgdorferi 14 beschrieben. In jedem Fall erfordert eine zweideutige IFA Ergebnis wie diese alternative Ansätze wie Oberfläche Biotinylierung oder Oberfläche Proteolyse um festzustellen, ob das Protein von Interesse Oberfläche exponiert sind oder nicht 10 ist.
Abbildung 1. Ablaufschema für die Oberfläche Immun-Fluoreszenz-Assay von Leptospira interrogans Spirochäten. Zuerst wird 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-und Kammer-Objektträgern aufgenommen (mindestens zwei Rutschen für jedes Experiment) und inkubiert Leptospiren zu halten. Als nächstes werden Leptospiren zu Kammer-Objektträgern durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd (PFA) für Proben mit intakten äußeren Membran (OM) und 1 ml / well aus 100% kaltem Methanol für Proben mit permeabilisierten OM fixiert. Als nächstes werden Leptospiren mit Antikörpern, die Oberflächen-exponierten Proteine zusammen mit Kontroll-Antikörper für die unterirdische Proteine (Primary AB) bei 30 ° C für 90 min inkubiert. Dann werden die primären Antikörper durch Inkubation mit 1 ml / well des Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Schließlich werden die Zellen visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie.
Abbildung 2. Oberfläche Immunfluoreszenz Analyse von Leptospira-Proteine. Leptospira interrogans Spirochäten wurden mit Immun-und Prä-Immunseren sondiert und negativen Ergebnisse wurden mit einer DAPI Gegenfärbung gepaart, um das Vorhandensein von Spirochäten nachweisen. Eine grüne Fluoreszenz-Filter verwendet wurde, um Alexa Fluor 488 markierten sekundären Antikörper-Bindung an exponierten Proteine und blau / cyan Fluoreszenzfilter Oberfläche DAPI Bindung an Zell-DNA erkennen zu erkennen. A) Leptospiren sondiert mit Antikörpern, die eine Oberfläche ausgesetzt Protein, OmpL54 10. B) Zellen sondiert mit Antikörpern gegen ein periplasmatischen Untergrund Protein, FlaA1 (negative Kontrolle). C) Die Zellen sondiert mit Antikörpern gegen Leptospiren Porin, OmpL1. Die Bindung von Kaninchenseren auf Leptospiren wurden mit Alexa Fluor 488 konjugierten Ziege anti-Kaninchen-IgG-Fragmente nachgewiesen werden. Alle Bilder sind nach 4 Sek. langen Belichtungszeiten aufgenommen.
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Discussion
Unsere Oberfläche IFA-Technik ist ähnlich, mit dem die Oberfläche Exposition verschiedener Borrelien 15, 16 und Leptospira 12, 17 Proteine zu demonstrieren. Die Details der Oberfläche IFA hier beschriebene Methode sollen die Manipulation von Zellen in dem Bemühen um äußere Membran Integrität zu erhalten minimieren und gleichzeitig die Vorteile der Tendenz der Leptospira Zellen auf Glas-Objektträger haften. Das Verfahren beinhaltet eine niedrigere Konzentration (2% versus 4%) Paraformaldehyd, Waschen mit äußeren Membran stabilisierende Puffer (PBS + 5 mM MgCl 2) und weniger Waschschritte als bisher veröffentlichten Protokollen 12, 17. Darüber hinaus unterstreicht unsere Oberfläche IFA-Methode die Bedeutung der Kontrollen, die die Voraussetzung für genaue Interpretation der Daten sind. Eine Einschränkung der Methode ist, dass die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern, die in der Lage zu erkennen Epitop (e) des Proteins von Interesse Oberfläche exponiert sind, erfordert. In einigen Fällen kann sterische Hinderung durch andere Oberfläche Proteine oder Lipopolysaccharide verhindern Antikörper-Antigen-Bildung. Dennoch ist die Oberfläche IFA-Methode eine relativ einfache Technik für die direkte Beurteilung der Oberfläche Exposition von Proteinen und kann entweder als Stand-alone-Ansatz oder in Absprache mit anderen Techniken, wie Immunogoldmarkierung, Oberfläche Proteolyse, etc. verwendet werden
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Public Health Service gewähren unterstützt AI-34431 (bis DAH) vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases und VA Medical Research Funds (bis DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M.
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A.
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A.
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
