Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.
Abstract
Transcriptiefactoren binnen mobiele netwerken gen de controle van de spatio-temporele patroon en het niveau van expressie van hun doelwitgenen door binding aan cis-regulatorische elementen (Cres), korte (~ 300 tot 600 bp) strekt zich uit van genomisch DNA die stroomopwaarts kan liegen, stroomafwaarts, of binnen de introns van de genen die ze controleren. CRES (dat wil zeggen, enhancers / promotors) meestal bestaan uit meerdere geclusterde bindingsplaatsen voor zowel transcriptionele activators en repressoren 1-3. Ze dienen als logische integrators van transcriptionele inbreng geven van een unitaire output in de vorm van spatiotemporally precies en kwantitatief exact promotor activiteit. De meeste studies van zoogdieren cis-regulering tot op heden hebben vertrouwd op de muis transgenese als een middel van het testen van de enhancer-functie van Cres 4-5. Deze techniek is tijdrovend, duur en, op grond van plaats van inbrengen effecten, die grotendeels niet-kwantitatief. Aan de andere kant hebben kwantitatieve assays voor zoogdieren CRE-functie is ontwikkeld in weefselkweek systemen (bijvoorbeeld, dubbele luciferase assays), maar de in vivo relevantie van deze resultaten is vaak onzeker.
Elektroporatie biedt een uitstekend alternatief voor de traditionele muis transgenese in dat het mogelijk maakt zowel de spatiotemporele en kwantitatieve beoordeling van cis-regulerende activiteit in levende zoogdieren weefsel. Deze techniek is vooral nuttig bij de analyse van de cis-regulering in het centrale zenuwstelsel, met name in de cerebrale cortex en het netvlies 6-8. Terwijl de muis het netvlies elektroporatie, zowel in vivo en ex vivo, is ontwikkeld en uitvoerig beschreven door Matsuda en Cepko 6-7,9, hebben we recent ontwikkelde een eenvoudige benadering om de activiteit van fotoreceptor-specifieke CRES kwantificeren in geëlektroporeerd muis netvlies 10. Gezien het feit dat de hoeveelheid DNA die in het netvlies geïntroduceerd door elektroporatie kan variëren van experiment om te experimenteren, is het noodzakelijk om onder andere een co-geëlektroporeerd 'laden control' in alle experimenten. In dit opzicht is de techniek is zeer vergelijkbaar met de dubbele luciferase assay gebruikt om de promoter activiteit in gekweekte cellen te kwantificeren.
Bij het testen van fotoreceptor cis-regulerende activiteit, wordt elektroporatie meestal uitgevoerd bij pasgeboren muizen (postnatale dag 0, P0), dat is de tijd van de piek staaf productie 11-12. Zodra het netvlies celtypes worden post-mitotische, elektroporatie is veel minder efficiënt. Gezien de hoge mate van staaf geboorte in pasgeboren muizen en het feit dat staven meer dan 70% van de cellen in het volwassen muis netvlies vormen de meerderheid van de cellen die zijn geëlektroporeerd op P0 zijn staven. Om deze reden, staaf fotoreceptoren zijn het makkelijkst netvlies celtype om te studeren via elektroporatie. De techniek die we hier beschrijven is vooral nuttig voor het kwantificeren van de activiteit van fotoreceptor Cres.
Protocol
1. De bouw van de elektroporatie kamer
- Bestel een microslide, BTX Model 453 met een 3,2 mm gat (Harvard Apparatus # 45-0105) (Fig. 2A). De metalen rails moet volledig worden afgedicht aan de onderkant van de dia.
- Gebruik een Dremel gereedschap om een handvat sneed een plastic microcentrifugebuis rek. Snijd de steel in 5 kleine rechthoekige stukken elk met de volgende afmetingen: lengte 0.8cm, hoogte 0,6 cm, breedte 0.3cm (Fig. 2B). Deze stukken zijn herbruikbaar plastic afstandhouders die zullen worden gebruikt om individuele putten schimmel in de microslide kamer.
- Plaats de kunststof afstandhouders tussen de metalen rails van de microslide met gelijke tussenruimten. De afstandhouders moet goed passen (fig. 2C).
- Snijd de tip een P200 pipet tip, monteer de tip om een 3 ml spuit, en vul de spuit met 100% siliconen rubber aquarium kit. Vul de openingen tussen de kunststof afstandhouders met kit. Zorg ervoor dat de leemtes op te vullen van de bottom-up, zodat er geen luchtbellen vormen tussen de kit plug en de basis van de microslide.
- Plaats een metalen staaf boven op de kunststof afstandhouders en zet deze met een bindmiddel clips, zodat de afstandhouders worden op hun plaats gehouden, terwijl de kit droogt (fig. 2D-E). Laat de kit 's nachts droog.
- Verwijder het bindmiddel clips, metalen staaf, en kunststof afstandhouders (fig. 2F). Gebruik een scalpel om de kit schoonmaken van de bovenkant van de metalen rails. Gebruik een dissectiemicroscoop aan de microslide onderzoeken en dat er geen luchtbellen aanwezig zijn op de bodem van de siliconen dammen te verzekeren. Verwijder alle kit film die zijn gevormd in de putten, zodat blank metaal wordt blootgesteld in de putten. Vul een goed met water en zorg ervoor dat het water niet lekken in de aangrenzende goed (s). Herhaal dit voor alle putten.
- De afgewerkte microslide past in de plastic schaal met de metalen palen naast het raam in de zijkant van de schotel (fig. 2G), de elektroden zal uiteindelijk worden bevestigd aan de metalen palen.
2. DNA-voorbereiding
- Voeg plasmide DNA om een 1,5 ml microcentrifugebuis op ijs en breng het volume tot 150μl met gedestilleerd water. Meerdere plasmide soorten kunnen worden gecombineerd voor co-elektroporatie (bijvoorbeeld een experimentele DsRed bouwen en een controle GFP construct). Bij de berekening van de hoeveelheid DNA toe te voegen aan de buis, in gedachten houden dat het uiteindelijke volume van de DNA hoeveelheid zal 60μl worden. Doorgaans wordt elk construct gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0.5μg/μl.
- Neerslag van het DNA door het toevoegen van 15μl 3M natriumacetaat (pH 5,2) en 450μl 100% ethanol. Omkeren of tik op de buis een paar keer om te mengen.
- Spin down het DNA bij 4 ° C, 13.200 rpm, gedurende 30 minuten. Was de pellet met 70% ethanol en draai het naar beneden weer bij 4 ° C, 13.200 rpm, gedurende 15 minuten. De lucht drogen van de korrel tot de semi-doorzichtig, ongeveer 7 minuten, daarna opnieuw in suspensie in 54μl steriel water. Voeg 6μl steriel 10X PBS (pH 7.4) en meng.
3. Oog collectie
- Steriliseer de elektroporatie kamer en alle instrumenten met 70% ethanol. Terwijl de ogen verzamelen en dissectie hoeft niet te worden uitgevoerd in een weefselkweek kap, ontsmet je handschoenen en benchtop met ethanol en proberen om steriele omstandigheden te behouden tijdens de gehele procedure.
- Bereid Petri gerechten met dissectie medium (1:1-verhouding van DMEM: F12, 100U/ml penicilline, streptomycine 100μg/ml, 0.29mg/ml L-glutamine, en 5μg/ml insuline): twee 35mm schalen met elk 3 ml medium en een 60mm schotel met 6 ml medium. Deze stap moet worden uitgevoerd in een weefselkweek kap.
- Ontsmet het hoofd en de nek van een pasgeboren (postnatale dag 0) muis pup met 70% ethanol. Snel onthoofden met een schaar en breng het hoofd naar een steriele 100mm schotel.
- Knip de hoofdhuid met een klein schaartje voor de ogen bloot te leggen. Gebruik gebogen tang voorzichtig schep het oog uit van de baan, en plaats het oog in een 35mm schotel met dissectie medium. Het kan nuttig zijn om de ogen te verwijderen onder een dissectiemicroscoop op laag vermogen.
- Herhaal de stappen 3.3 en 3.4 tot alle ogen zijn verzameld. Houd ogen in dissectie medium bij kamertemperatuur tijdens het ontleden. U moet drie tot vier ogen per DNA aliquot deel.
4. Retinale dissectie
- Gebruik 70% ethanol om zowel een scheermesje en het dekblad van een steriele plastic transferpipet desinfecteren. Snijd de tip van de pipet met het mes, zodat het kan zuigen een hele oog. Bewaar de pipet in de plastic verpakking wanneer niet in gebruik.
- Overdracht een oog van de 35mm schotel naar de 60mm schotel. Onder de microscoop ontleden op hoog vermogen, gebruik van fijne tang op een weefsel te verwijderen, zoals extraoculaire spieren en vet, van het oppervlak van het oog. Verwijder vervolgens de oogzenuw door te knijpen het af aan de basis.
- Met het oog op het netvlies te isoleren, prik een klein gaatje in de sclera bij de limbus. Plaats een uitsteeksel van de beide paren van pincet in het gat (raakt aan het netvlies oppervlak) en voorzichtig openscheuren de sclera / RPE. In albino muizen, de sclera en de RPE lijken glanzende ten opzichte van het netvlies weefsel, dat een homogene matte grijze kleur. In gepigmenteerde muizen, de RPE is zwart. Laat de lens op zijn plaats.
- Gebruik de overdracht pipet om de ontleed netvlies te verplaatsen naar de andere 35mm gerecht met medium.
- Herhaal de stappen 4,2 tot 4,4 totdat alle ogen zijn ontleed.
- Bewaar de retina's in een 37 ° C weefselkweek incubator totdat u klaar bent om electroporate.
5. Voorbereiding voor elektroporatie
- Bereid 35mm gerechten van medium. Voor elke DNA-hoeveelheid te worden geëlektroporeerd, moet je een schotel van dissectie medium en een schotel van kweekmedium (dissectie medium plus 10% FBS). Passend etiket van de gerechten.
- Gebruik een P200 pipet en steriele 1X PBS te spoelen van de kamers in de elektroporatie schotel. Elke kamer heeft een volume van 60-100μl. Spoel de elke kamer drie keer.
- Vul de kamers met het DNA monsters. Ongebruikte kamers moet gevuld worden met 60μl 1X PBS. Verbind de elektroden met de elektroporatie schotel.
- Gebruik de volgende instellingen op de electroporator: mode, LV, spanning, 30V, puls lengte, 50 msec, het aantal pulsen, 5, interval, 950 msec, polariteit, unipolair.
6. Elektroporatie
- Gebruik fijn pincet aan het netvlies te vatten door de lens en over te brengen in de elektroporatie kamers. Elke kamer kan maximaal tot 3-4 muis netvliezen (afb. 3).
- Een tang om line-up van de netvliezen zodanig dat de lens leunt tegen de metalen staaf aan de positieve elektrode. Reinig de tang met een Kimwipe na elke overdracht om te voorkomen dat overdracht van DNA van de ene kamer naar de volgende.
- Zodra alle netvliezen zijn afgestemd, drukt u op "Start" op de electroporator. Kleine belletjes moeten vormen op de metalen balk die aan de negatieve elektrode.
- Koppel de elektroden en zet de electroporator.
- Gebruik een tang om voorzichtig te verplaatsen het netvlies weg van de wanden.
- Gebruik een steriele pipet overdracht naar de netvliezen transfer van de kamers in de 35 mm platen met dissectie medium.
- Spoel de elke kamer drie keer met steriele 1X PBS en spoel na met steriel water. Spray schotel met 70% ethanol.
7. Het plaatsen van netvliezen op filters voor cultuur
- Gebruik een transfer pipet om het netvlies te zetten in de 35mm platen met kweekmedium.
- Het etiket van de putten van een steriele 6-well cultuur bord en vul elk goed met 3 ml kweekmedium.
- Gebruik steriele pincet te ronden Whatman Nuclepore filters, glimmende kant naar boven, boven op het medium in elk putje.
- Onder een microscoop ontleden, gebruik dan een steriele pipet overdracht naar de netvliezen transfer op de filter, lens-side-down. Als het netvlies landt lens-side-up, pak het op met de pipet en de poging om weer plaats. Niet meer dan 4 netvlies op een filter, en zorg ervoor dat de druppels van het medium rond elke netvlies blijven gescheiden van de andere druppels. Merk op dat we het netvlies cultuur met de lens intact, maar andere protocollen oproep voor de verwijdering van de lens voorafgaand aan deze stap 9.
- Plaats de cultuur plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator (5% CO 2) en groeien voor de gewenste hoeveelheid tijd, meestal acht dagen. In onze ervaring, het veranderen van het medium is niet nodig tijdens de periode van acht dagen cultuur, hoewel een medium verandering kan nodig zijn voor langere periodes cultuur.
8. Oogsten en flatmounting fluorescerende netvlies explanten
- Vervang het kweekmedium in elk putje met 4% paraformaldehyde / 1X PBS. Als het netvlies blijven kleven aan de filters, een tang om de filters om te draaien en zachtjes pel de netvliezen van het filter. Incubeer in paraformaldehyde gedurende 30 minuten. bij kamertemperatuur. Bescherm de retina van licht om te voorkomen dat het bleken van de fluorescentie.
- Twee keer Spoel het netvlies gedurende 10 minuten in 1X PBS.
- Gebruik een wegwerp pipet, om het netvlies overbrengen op een glasplaatje in een kleine daling van PBS. Onder een tl-dissectiemicroscoop een tang om het netvlies flip, zodat ze geëlektroporeerd-side-up (dat wil zeggen, lens-side-down).
- Plaats het glas "voeten" gemaakt van gemalen dekglaasjes (glas scherven ongeveer 1-2 mm in diameter) op de hoeken van de dia, deze voeten te voorkomen afvlakking van het netvlies. Plaats een intacte glazen dekglaasje over de dia zodat het betrekking heeft op de retina en de rust op de voeten. Gebruik indien nodig een pipet om meer PBS toe te voegen tussen de glijbaan en het dekglaasje.
9. Imaging en kwantificering van de fluorescentie in flatmount
- Gebruik eenfluorescerende verbinding microscoop uitgerust met een monochrome camera om het imago van de flatmounted netvlies bij laag vermogen (4x objectief) in de rode en groene kanalen. Alle netvliezen moeten worden afgebeeld met dezelfde belichtingstijd voor een bepaalde tl-kanaal om een vergelijking van de fluorescentie-intensiteiten mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de pixels niet verzadigd zijn in een beeld, of anders accurate kwantificering zal onmogelijk zijn. Export afbeeldingen in grijstinten TIFF-formaat.
- Open de afbeelding voor een netvlies (dat wil zeggen .., rode kanaal en groene kanaal) in ImageJ software ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). Omwille van deze tutorial, het groen fluorescerend kanaal (GFP-eiwit) is de controle-construct dat is constant over alle netvlies in het experiment. De rode tl-kanaal (DsRed eiwit) is de experimentele constructie die varieert voor elke set van het netvlies. De beelden worden in grijstinten.
- In ImageJ, selecteert u de controle groene imago en geef een cirkel van belang met een diameter van 100 eenheden (Analyze / Tools / ROI manager / Meer / opgeven). Kopieer de cirkel (ROI manager / toevoegen) om acht cirkels in totaal te creëren. Verhuizen cirkels 1-5 om vijf regio's die uniform worden geëlektroporeerd te selecteren, het vermijden van de buitenste randen van het netvlies en de regio boven de lens (Fig. 4A). Selecteer ook drie regio's (cirkels 6-8) buiten het netvlies / lens op de achtergrond fluorescentie te meten. Selecteer de rode afbeelding, verwijder het vinkje bij "Toon alle" box in ROI-manager, en controleer opnieuw de doos. Alle acht rondjes moeten verschijnen op de rode beeld. De select-all cirkel coördinaten in ROI manager.
- Met de rode afbeelding is geselecteerd, nemen de gemiddelde pixel waarde voor alle kringen van belang (ROI manager / Measure); metingen 1-8 zou moeten verschijnen, waar 1-5 worden de rode netvlies metingen en 6-8 zijn de rode achtergrond metingen. Selecteer het groene imago en noteer de gemiddelde pixelwaarde; metingen 9-16 verschijnen, waarbij 9-13 zijn de groene netvlies metingen en 14-16 zijn de groene achtergrond metingen. Kopieer de meetgegevens in Excel voor analyse (Fig. 5).
- Het gemiddelde van de drie achtergrond metingen in zowel de rode en groene kanalen. Trek de rode achtergrond gemiddelde van elk van de vijf netvlies metingen in het rode kanaal, te herhalen voor het groene kanaal. Voor elke regio netvlies-of-interest, verdeel de achtergrond-gecorrigeerde, rood meting door de achtergrond-gecorrigeerde meting van groen om de experimentele rode niveau normaliseren van de controle groene niveau (Fig. 5).
- Bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie van alle genormaliseerd metingen voor een bepaalde DsRed construct (bijvoorbeeld 5 metingen per netvlies keer drie aparte netvlies). Om kwantitatief de resultaten van electroporations op verschillende dagen uitgevoerd vergelijken, altijd een "standaard" DsRed / GFP neerslag in elke elektroporatie set. Relatieve expressie waarden in de experimenten kan worden vergeleken door het normaliseren van de expressie niveau van deze "standaard".
10. Representatieve resultaten:
Een goede elektroporatie resultaten in expressie van de DNA-construct (s) over 1 / 4 tot 1 / 3 van de retinale oppervlak (Fig. 4A). Aangezien de staaf fotoreceptoren in het bijzonder efficiënt getransduceerd, deze techniek is ideaal voor het kwantificeren van fotoreceptor-specifieke promoter activiteit (Fig. 4B). We hebben eerder gebruik gemaakt van deze aanpak voor een reeks van promotor varianten van de staaf-specifieke Rho en Gnat1 loci 10 kwantificeren. We vonden dat het mogelijk is om promotor activiteit kwantificeren over een bijna 300-voudig bereik.
Figuur 5 is een voorbeeld dataset uit een geëlektroporeerd netvlies. In dit specifieke voorbeeld, werd de experimentele constructie pNrl (1.1kb)-DsRed gemeten in het rode kanaal en de controle construct pNrl (3.2kb)-GFP werd gemeten in het groene kanaal. Een complete dataset voor de pNrl (1.1kb)-DsRed constructie zou bestaan van 6-9 netvlies gemeten op deze manier, en standaard deviatie zou worden berekend op basis van alle "DsRed genormaliseerd om GFP" waarden. Als we het vergelijken van de expressie van pNrl (1.1kb)-DsRed, bijvoorbeeld, pNrl (0.8kb)-DsRed, dan beide constructen zou moeten worden geëlektroporeerd met dezelfde GFP controle (bijv. pNrl (3.2kb) - GFP) en afgebeeld op dezelfde belichtingstijden. Het is mogelijk om pool gegevens die zijn verzameld op verschillende dagen als een standaard DsRed / GFP elektroporatie wordt uitgevoerd op elke dag (bijv. pNrl (3.2kb)-DsRed + pNrl (3.2kb)-GFP). Voor elk experimenteel bouwen, zou de genormaliseerde DsRed niveau vervolgens worden genormaliseerd om de genormaliseerde DsRed niveau van de "standaard" (pNrl (3.2kb)-DsRed).
De techniek die we hier beschrijven is vooral nuttig voor het kwantificeren van de activiteit van afdrukband CRES 10,13.Cel-type specifieke cis-regulerende activiteit kan ook worden gekwantificeerd in zeldzamer retina celtypes zoals bipolaire cellen 14, maar meestal vereist dat de gebieden die van belang te worden gekwantificeerd worden geselecteerd in verticale doorsnede in plaats van in flatmount preparaten. Hetzelfde geldt voor Cres, die uitdrukking rijden in meerdere celtypen, zoals fotoreceptoren en bipolaire cellen. De experimentele procedures zijn anders vergelijkbaar.
Figuur 1. Overzicht van het netvlies explantaat elektroporatie procedure. De eerste, hele ogen zijn geïsoleerd van postnatale dag 0 muis pups en het netvlies worden ontleed (P1). Ten tweede worden de retina's geplaatst in kamers gevuld met DNA en geëlektroporeerd (P2). Ten derde worden de retina's geplaatst op filters en gekweekt gedurende acht dagen (P3). Vierde, zijn de retinale explantaten vaste, gemonteerd op dia's, en afgebeeld. Fluorescentie-intensiteit wordt gemeten met ImageJ software (P4). Ten vijfde, zijn de ImageJ die worden verwerkt in een spreadsheet-programma om het verschil in de activiteit van verschillende promoters (P5) te kwantificeren.
Figuur 2. Bouw van de elektroporatie schotel. A) Ongewijzigde microslide kamer van Harvard Apparatus, BTX model 453 (catalogus # 45 tot 0105). B) Een Dremel tool wordt gebruikt om het handvat afsnijden een plastic buis rek. Het handvat is gesneden in rechthoekige afstandhouders met de volgende afmetingen: lengte 0.8cm, hoogte 0,6 cm, breedte 0.3cm. C) De kunststof afstandhouders zijn voorzien in de microslide kamer met gelijke intervallen. Aquarium kit wordt geïnjecteerd in de openingen tussen de afstandhouders (niet afgebeeld). D) Een metalen staaf wordt geplaatst over de afstandhouders. E) De bar en de afstandhouders zijn geklemd op de dia met bindmiddel clips om alles op zijn plaats houden als de kit droogt 's nachts. F) De afstandhouders worden verwijderd en de putten worden getest om ervoor te zorgen dat ze waterdicht zijn. G) De afgewerkte schuift past in de plastic schaal met de metalen balken naast het raam in de zijkant van de schotel.
Figuur 3. Schematische voorstelling van de elektroporatie schotel met netvliezen. De kamers zijn gevuld met DNA-oplossingen (maximaal vijf verschillende oplossingen op een tijd). Netvliezen worden geplaatst in de kamers en gericht, zodat de lens leunt tegen de metalen staaf verbonden met de positieve elektrode, drie of vier netvlies past in elk van de vijf kamers. De elektrische stroom zorgt ervoor dat de negatief geladen DNA-moleculen te verplaatsen in de retinale cellen.
Figuur 4. A) ImageJ meting van het netvlies fluorescentie niveaus in flatmount. Grijstinten flatmount afbeeldingen in de DsRed (experimentele) en GFP (controle) kanalen worden geopend in ImageJ software; er rekening mee dat deze beelden zijn ingekleurd alleen voor illustratieve doeleinden. Vijf meting cirkels (1 tot en met 5) zijn geplaatst over uniform geëlektroporeerd regio's, het vermijden van de randen en de lens (stippellijnen). Drie metingen cirkels (6 tot en met 8) worden geplaatst buiten het netvlies op de achtergrond fluorescentie te bepalen. B) Cross-sectional beelden van een geëlektroporeerd netvlies explantatie op hoog vermogen. De explant werd vastgesteld op postnatale dag 8, cryoprotected in 30% sucrose/1X PBS overnacht bij 4 ° C, ingebed in oktober, en cryo-doorsnede bij 12μm. De fluorescerende construeert pNrl (1.1kb)-DsRed en pNrl (3.2kb)-GFP worden uitgedrukt in fotoreceptorcellen in de buitenste nucleaire laag (ONL). INL, binnenste nucleaire laag; GCL, ganglion cel laag.
Figuur 5. Verwerking van gegevens met behulp van fluorescentie Excel. In stap 1, is de gemiddelde pixelwaarde voor elke meting cirkel gekopieerd naar de spreadsheet (cellen B3-B12, F3-F5, H3-H5). Metingen # 1-5 worden de DsRed netvlies waarden en # 6-8 zijn de DsRed achtergrond waarden; metingen # 9-13 zijn de GFP netvlies waarden en # 14-16 zijn de GFP achtergrond waarden. Merk op dat de meting # 1 en # 9 komen overeen met dezelfde meting cirkel, net als de metingen # 2 en # 10, en ga zo maar door. In stap 2, is de gemiddelde waarde voor de achtergrond DsRed en GFP-kanalen berekend (cellen F6, H6). In stap 3, de gemiddelde achtergrond wordt afgetrokken van elke retina meting (cellen C3-C12). In stap 4, elke achtergrond-gecorrigeerde DsRed meting is genormaliseerd naar de bijbehorende GFP meting (cellen D3-D7).
Discussion
Explantatie elektroporatie is een eenvoudige manier te kwantificeren cis-regulerende activiteit in de zich ontwikkelende muis netvlies. In vergelijking met cis-regulatorische analyse via de muis transgenese, elektroporatie is veel goedkoper, is er slechts pasgeboren muis pups, DNA, ontleden instrumenten, en elektroporatie / weefselkweek apparatuur. Het is ook veel minder tijd in beslag: een experiment vereist slechts een paar uur van de voorbereidingstijd, een cultuur periode van ongeveer acht dagen, en een paar uur aan het eind van het experiment voor de beeldvorming en data-analyse. Explantatie elektroporatie is ook superieur aan celcultuur gebaseerde cis-regulatorische analyse omdat de werkelijke retinaal weefsel wordt gebruikt. Het netvlies ontwikkelt zich heel normaal in explantatie cultuur-it maakt drie verschillende cellulaire lagen (buitenste nucleaire laag, binnenste nucleaire laag en ganglion cellaag), hoewel fotoreceptoren niet buitenste segmenten uit te werken.
Een ander voordeel is dat Explantatie elektroporatie is zeer reproduceerbaar. Dezelfde constructen geëlektroporeerd in verschillende netvlies, zelfs op verschillende dagen, meestal resulteert in dezelfde relatieve expressie niveaus. Aangezien de geëlektroporeerd plasmiden wordt gedacht dat episomally worden gehandhaafd in de kern en zijn niet opgenomen in de chromosomen, zij niet lijken te zijn onderworpen aan dezelfde integratie plaats effecten die cis-regulatorische analyse uitgevoerd in transgene muizen mee kampen.
Explantatie elektroporatie heeft wel een aantal beperkingen. Ten eerste kan alleen cellen die nog in de cel cyclus efficiënt worden getransduceerd door elektroporatie 15. Bij P0, staven en andere later geboren netvlies celtypen (bipolaire cellen, amacrine cellen, M ller glia) zijn de belangrijkste celpopulaties het doelwit van deze methode. Elektroporatie van de kegel fotoreceptoren door P0 elektroporatie is gemeld, maar het rendement 16 lijkt laag te zijn. Een tweede beperking is dat explantatie cultuur buiten de twee weken resulteert in een progressieve afwijking van het netvlies en wordt daarom niet aanbevolen. Als promotor kwantificering is nodig op late tijdstippen, maar een in-vivo electroporatie 9 kan worden uitgevoerd, gevolgd door het netvlies dissectie op de gewenste tijdpunt, flat-montage van de ontleed netvlies, en kwantificering zoals beschreven in hoofdstuk 9. Een derde beperking is dat deze test is slechts matig high-throughput. In tegenstelling tot de celcultuur-gebaseerde testen die kunnen testen honderden constructen in een enkel experiment, de techniek beschreven in dit protocol vereist een minimum van een hele muis netvlies per bouwen. Zo kan slechts een paar dozijn construeert redelijkerwijs kan worden geëlektroporeerd in een dag.
Een extra waarschuwing met betrekking tot de kwantificering van de promotor activiteit met behulp van de huidige aanpak is dat er een potentieel voor 'bloeden-through' van DsRed fluorescentie in het GFP-kanaal, met name bij het testen van een zeer sterke promotors. De reden hiervoor is dat het emissiespectrum van overlapt gedeeltelijk die van GFP DsRed. Te omzeilen dit probleem, moet geoptimaliseerd emissie-filters worden gebruikt, dat het minimaliseren van de spectrale overlap tussen DsRed en GFP. Wanneer dergelijke geoptimaliseerde filter sets niet beschikbaar zijn, zou een andere mogelijke oplossing is om een blauw-verschoven fluorescerend eiwit (bijvoorbeeld, BFP of GVB) te gebruiken in plaats van GFP.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen Karen Lawrence bedanken voor haar hulp bij de sectie beschrijven constructie van de elektroporatie kamer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporation dish, Microslide 453 | BTX Technologies | 45-0105 | See protocol section 1 for modifications |
| 100% silicone rubber aquarium cement | Perfecto Manufacturing | ||
| Plastic microtube rack | Fisher Scientific | 05-541 | Only the rack handle will be used |
| Dremel tool | For cutting the handle off the plastic tube rack | ||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| L-Glu/pen/strep | GIBCO, by Life Technologies | 10378-016 | 100X concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | For 1000X stock, resuspend at 5mg/ml in 5mM HCl and filter-sterilize |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 26140-079 | |
| ECM 830 Square-wave electroporator | BTX Technologies | ||
| Nuclepore filters | Whatman, GE Healthcare | 110606 | 25mm, 0.2μm |
| Tissue culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Glass coverslips #1.5 | Fisher Scientific | 12-544E | 0.16mm thick |
| Fluorescent compound microscope equipped with camera | Camera should be monochromatic (e.g., ORCA-ER camera by Hamamatsu) | ||
| EGFP/DsRed filter set for compound microscope | Chroma Technology Corp. | 86007 | This filter set minimizes bleedthrough between the red and green chanenels |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).
- Davidson, E. H. Genomic regulatory systems : development and evolution. , Academic Press. (2001).
- Ptashne, M., Gann, A. Genes & signals. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).
- Blow, M. J. ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers. Nat Genet. 42, 806-810 (2010).
- Visel, A. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites. Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine. J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).
- Young, R. W. Cell differentiation in the retina of the mouse. Anat Rec. 212, 199-205 (1985).
- Corbo, J. C. CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors. Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).
- Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression. J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation. Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).
