高齢者とパーキンソンラットにおける超音波発声の対象とトレーニング

Summary

音声障害は、老化とパーキンソン病で衰弱させるされています。また、これらの条件によって影響を受けるラットの超音波発声は、、これらの音声障害、それらの神経基質、および行動的介入による機能回復の性質を研究するために使用することができます。

Abstract

音声障害はパーキンソン病（PD）と老化の両方の一般的な合併症である、彼らはかなりのコミュニケーション能力に影響を与えることによって生活の質を悪化させることができる^1、2ターゲットトレーニング（音声/音声療法は）特定の音声の赤字を改善することができる^、3、4が。行動的介入の基礎となるメカニズムはよく理解されていない。音声の赤字と治療の体系的調査は、年齢、家庭環境、年齢、病気の後の発症、疾患の重症度、及び薬のような人間、で制御が困難な多くの要因を考慮する必要があります。ここで紹介する方法は、対象となるボイストレーニングと感覚運動メカニズムの変化の根底にある方法の体系的な研究を可能にする発声の動物モデルを使用しています。このプロトコールに記載されている超音波の記録および分析手順は、齧歯類超音波発声の任意の調査に適用可能である。

げっ歯類の超音波発声行動の神経基質を調査するために貴重なモデルとして浮上している^。5-8齧歯類とヒトの発声の両方が記号論的価値を運ぶと喉頭収縮と呼気の空気の流れを変更することによって生成される^。9、10をこのように、齧歯類の発声を感覚のコンテキスト内で音声の赤字を研究するために有用なモデルとすることができます。さらに、ラットのモデルは私たちが目標と訓練との赤字から回復の神経生物学的基盤を研究することができます。

モデルPDに我々は、のLong - Evansラット（チャールズリバーラボラトリーズインターナショナル、（株））を使用し、シナプス前の重度の変性中等度から発生する内側前脳束に6 - ヒドロキシドーパミン（6 - OHDA）7μgの一方的な注入によりパーキンソニズムを誘発する線条体ニューロン（詳細についてはCiucci、2010を参照^{）。11、12}高齢化モデルについては、我々は、フィッシャー344/BrownノルウェーF1（国立老化研究所）を使用します。

発声を引き出すために私たちの主な方法は、性的に受容雌ラットへの性的経験の雄ラットを公開することです。男性が女性に興味になると、女性は削除され、男性が発声し続けています。食物や水、両方の複雑な発声と発声の速度の数とやりがいのある複雑な発声によって（図1）増加することができます。

男性のホームケージの上にマウントされている超音波マイクは、発声を記録します。雌ラットは雄の呼び出しを分離するために削除された後に録音が始まります。発声は訓練のためにリアルタイムで表示または記録し、オフラインで分析することができます。ボーカルトレーニングの前と後の発声を録音し、音響的に分析することにより、疾患とトレーニングが正常な機能の回復の効果を評価することができます。また、このモデルでは、私たちは、脳や神経系の変化に観測された行動（ボーカル）の改善を関連付けることができます。

Protocol

1。プリ/ポストトレーニングレコーディング

1. 図2に示す構成を使用してAvisoftレコーダーで超音波監視を始める。
2. 超音波発声は、リアルタイムスペクトログラムを見て、視覚的にどちらかの監視、または聴覚的にヘッドフォンでは、超音波のレコーディングインターフェイスに接続することができます。
3. 対象雄ラットのホームケージに性的受容（発情期の）雌ラットを置きます。発情期の兆候は前彎、揺らす耳、そして迅速な投げ掛けるなどがあります。発情期の雌は、非性的受容女性よりも男性から多くの発声を引き出す。
4. 男性が女性への関心（例えば、追いかけて、スニッフィング、および/または取り付けを）示された後、女性を削除し、1〜2分のために男性の発声を記録。
5. 男性はすぐに発声していない場合は、一時的に発声を刺激する男性のホームケージに雌ラットを返します。

2。ボーカルトレーニング

1. 図2に示すように、同じ設定を使用してAvisoftレコーダーで超音波監視を始める。
2. マイクで自分のホームケージでの雄ラットを置きます。
3. 男性のホームケージに雌ラットを置く。前述したように、雌ラットは男性からの発声の応答を最大化するために発情期にある必要があります。
4. 男性は女性に関心を示すようにしたら女性を取り外します。
5. 男性がターゲットの発声を生成した直後に、ペンのクリックと水のボトルや食品の御馳走の簡単なプレゼンテーションと同時に報酬。最初は、どんな50 kHzの周波数変調された（図5B）の呼び出しは報われる。トレーニングはこのような立て続け5〜10コールの文字列としてコールしかますます複雑な文字列を、進行に応じて強化されています。
6. が30援軍を与えたまで、トレーニングセッションを継続する。これは通常、5の間に取る - 10分。

3。音響分析の準備

1. 分析は、各ファイルからノイズをフィルタリングし、消去が必要になるように常にアーカイブオリジナルのサウンドファイルをしように、作業コピーを編集して測定。
2. Avisoft SASLab Proのバッチモードを使用して、高域には超音波発声以下の不要なノイズを除去し、25 kHzで分析するすべてのサウンドファイルをフィルタリングする。
3. SASLab Proの自動検出機能を使用するためには、ノイズしきい値は、最初に決定する必要があります。これを行うには、サウンドファイルを開いて、図3に示す設定を使用してスペクトログラムを作成します。
4. 自動パラメータ測定の表示は図4に示すように、設定に従って設定する必要があります。
5. の通話や音がないスペクトログラムの領域を見つける、これはバックグラウンドノイズです。
6. "自動（単一のしきい値）"オプションを使用して、ちょうどスペクトログラム上のパワースペクトルウィンドウに黒い線を調整して、背景のノイズ上記の自動パラメータ測定のセットアップ]ダイアログボックスの要素の分離部のしきい値を設定します。図4では、しきい値は-55 dBに設定されています。
7. ダイアログボックスの下部には、前述の手順で見つけたスレッショルドを1 dBまでの値"ピーク振幅よりも小さい場合に拒否"を設定する。これらの2つの値は、現在、すべての録画の設定が同じだったと仮定し、分析したすべてのサウンドファイルを使用する必要があります。

4。発声の識別

1. 上記の設定自動しきい値を使用して、発声にラベルを付けるには、まず、上記の設定でスペクトログラムを作成します。
2. 手動で次の基準満たす任意のノイズ消去：1）誤って発声、2）として同定されたことにより開始および/または発声の終わりの差別に影響を及ぼしている、および/または3）が誤って最高かとして同定されている発声の最低周波数（それぞれ、上限と下限の赤線で示される）。また、発声ラベルの開始/終了時刻は下記のステップ4.5の永続的なラベルを作成した後で手動で調整することができます。高と低周波測定に影響を与えるノイズが、しかし、手動で消去する必要があります。
3. いくつかのケースでは発声は、このような運動中の寝具の音など、周囲のノイズから分離することができなくなります。これらのケースでは、呼び出しを正確に分析することができないと消しておく必要があります。
4. 一度、すべての発声が同定されている、永久的に選択することで、サウンドファイルからスペクトログラムの削除の項を消去する"波形から消去されたスペクトログラムのセクションを削除..."[ツール]ドロップダウンメニューから。スペクトログラムが閉じられる前に、このコマンドが実行されていない場合、すべて消去の作業はすべて失われます。
5. 自動パラメータ測定のセットアップウィンドウの素子分離のセクションで"編集"ボタンをクリックして、サウンドファイル内の永続的なラベルを作成します。
6. 変調されたシンプルな、周波数（FM）、または高調波：視覚と聴覚のカテゴリを決定するためにラベル付きの各発声を確認してください。尻IGN事前定義されたテキストモジュールを使用して適切なラベル。各発声のカテゴリの例を図5に示されています。
7. スペクトログラムを閉じて、サウンドファイルを保存し、分析するために次のサウンドファイルに進みます。

5。音響測定

1. 自動的にすべてのファイルの音響パラメータを測定するために：すべてのサウンドファイルが識別されているに発声した後、バッチ処理ツール（バッチ処理ツール）を使用します。
2. バッチ処理ダイアログボックスで、ドロップダウンメニューから"自動パラメータ測定"を選択します。
3. "プロセスを選択したフォルダ内のすべてのファイル"チェックボックスを選択し、"フォルダ"ボタンをクリックし、サウンドファイルが保存されているフォルダを選択します。
4. クリックして"Start"ボタンをクリックして各ファイルは、自動的に最後の自動パラメータ測定のセットアップのダイアログボックスで使用されている設定に従って解析されます。
5. 測定は、DDEパラメータ/ログファイルの設定コマンドを使用して定義することができるテキストフ​​ァイルに保存されます。このテキストフ​​ァイルは、統計分析のためのプログラムにインポートすることができます。

6。代表的な結果：

ラットの超音波発声は、高齢化と6 - OHDAパーキンソン病のモデルに関連する生理的変化の影響を受けて^13は一般的に、我々は以下の定量的な音響パラメータの減少によって特徴付け超音波発声の質の低下を参照してください：。帯域幅、ピーク周波数、持続時間を、そして強さ。 PDの誘導後にベースライン、、そして発声のトレーニング後：図6は、3つの異なる時点でPDモデルにおけるラットの周波数変調された発声を示しています。 PDの状態で、コールは帯域幅、期間、および強度の減少を示しています。さらに、周波数変調は、不規則になっています。

特定の音響パラメータの劣化に加えて、我々はまた、高齢者やパーキンソンラットで生産された発声の種類に少なく、全体的な複雑さを観察。たとえば、PDの誘導後のラットは、単純なコールとより少ない周波数変調されたコールの数が増えて生成します。以下の発声の訓練、などの持続時間や強度、アプローチのベースラインレベルと複雑なコール数が増加する（図6）など、多くの音響パラメータ、。老齢ラットでは、彼らの超音波発声の音響パラメータの同じような劣化をマニフェスト。我々は現在、老齢ラットでボーカルトレーニングの効果を調査している。

図1セッションあたりの発声（ターゲット毎週すべてのラットが満たして）と発声率（平均値と標準誤差が示されて）、両方の若者（9カ月）と古いのグループの6週間のトレーニング期間中の両方の増加（32の数MO）フィッシャー344/BrownノルウェーのF1ラット。

図2 50 kHzの発声の3つのカテゴリのそれぞれの代表的な発声;（A）単純な、（B）周波数変調、および（C）高調波。

図3シングル（A）ベースライン時、ラット、（B）後のPDの誘導、及び（C）後に発声のトレーニングからの代表的な周波数変調発声。

Discussion

ラットにおける超音波発声は、パーキンソン病などの老化や病気のプロセスに対して脆弱と思われる。これらの超音波発声は、病気や老化に起因する生理的変化に伴う財政赤字を含む、発声機能のビヘイビアモデルを、提供する。さらに、超音波発声の音響の変化を簡単に測定し、定量化されています。さらに、超音波発声は、行動的介入によって変更することができます。したがって、ラット超音波発声は老化、病気の影響を研究するための有用なモデル、および動作と基本的な神経生物学的メカニズムの両方の治療的介入を提供しています。

ボーカルトレーニングの手法は、正の強化（水や食料の御馳走の報酬）に関連付けられた条件刺激（クリック）を使用しています。報酬が続くのクリックが増加する複雑さの発声を強化するために使用されます。私たちは、"フラット"であると、単一の周波数（図5A）を維持するものと"トリル"（変調周波数）成分（図5B）を含むものとして、複雑な発声を定義する。この周波数変調成分は容易にその正弦波出現によって識別されます。 50 kHzの発声は、（図5B）完全に正弦波になるかもしれないが、それは部分的にこの周波数変調された成分だけでなく、周波数の大きいジャンプのどちらか短い平坦なコンポーネントで構成される、より複雑な50 kHzの発声が発生するのが一般的です。これらのより複雑な発声は、コンポーネント間の10ミリ秒未満の短い休憩があるかもしれませんが、単一の発声とみなされます。これらの発声のさらに詳細なサブ分類は^14、オフライン可能ですが、我々はオンラインで主観的な分類の必要性を削減し、補強のばらつきを減らすために複雑なような周波数変調成分を含むすべての50 - kHzの発声を分類する。あなた自身の研究室では、データは研究の目的に適した研究デザインによって分類して分析する方法を選択することが重要です。

このプロトコルを使用する際に考慮すべき多くの要因がある。まず第一に、遺伝的等質性と手続きの一貫性にもかかわらず、ラットでは、訓練への変数の応答を持っている。一部のラットは自然に、他の人よりも⁵以上を声に出すか、食物や水を報酬によってより多くの女性への暴露によって動機づけられている。我々はこの変動を考慮一つの方法は、個々のラットのベースラインの発声から、そのポスト病変と、トレーニング後の発声の音響パラメータの変化を調べることによって、です。このプロトコルで説明されていないが、我々はまた、マウントするために待ち時間など、女性の関心を定量化する行動アッセイを、持っている。さらに、個々のラットの年齢と活動レベルに応じて、ワイヤのトップは、エスケープを防止するためにトレーニング中にホームケージで必要な場合があります。個人差にもかかわらず、我々は個々のラットのベースラインを基準に発声を改善するために株や年齢の多様でこのプロトコルを正常に使用している。

ラットはそのような香り、温度、および人員などの環境の一見小さな変化に敏感です。努力は、ローション、ヘアケア製品、そして香水などの香りのパーソナルケア製品を、避けるためになされるべきである。訓練を試みる前に、個々がと相互作用し、ラットを取り扱う快適でなければなりません。また、担当者や環境の不整合は、ラットの発声の応答に影響を与える可能性があります。

ラットは夜行性なので、それらが最もアクティブな場合、そのサイクルの暗い部分の間に場所を取るトレーニングを可能にするために逆の光のサイクルで維持する必要があります。私たちは、赤いライトで私たちのトレーニングの部屋を照らす。さらに、水の報酬が訓練中に使用されている場合、ラットは水へのアクセスが制限されているはず。私たちのラットは、トレーニングセッションの前に21時間限定水です。水の曝露の三時間は、私たちの動物実験によって決定し、水が動物の健康や幸福にかなりの妥協を提示することなく、私たちの行動研究に補強材として有用であることが許可されて制限の少ない時間帯になる委員会を使用していた。ラットを訓練した後、ランダムな時間（30分〜10分）で水へのアクセスを与えられ、その後、それらの光サイクルの暗い部分の間に三時間のために水への無料アクセスを持っています。ラットは脱水の徴候がないか毎日点検して有意（10％以上）体重減少がないことを確認するために一日おきに比較考察すべきである。食事制限は、報酬として食糧御馳走を使用する場合は不要です。市販されているが、我々は効果的な報酬に甘いシリアルの小片を発見したラットに特異的に扱います。

前述したように、発情中の雌ラットは、非性的受容女性よりも男性からも高い発声の応答を引き出す。植民地の女性の多数を維持することで、高い可能性があることで少なくとも一人の女性は、任意の日で発情期になります。しかし、発情も薬理学的に皮下前に4時間のトレーニングの前に0.1 ccの滅菌ごま油でプロゲステロン500μgのに続いて研修〜0.1 ccの滅菌胡麻油48時間以内にβ-エストラジオール10μgを注入することにより、雌ラットで誘発することができます。また、雌ラットへのナイーブな雄のラットは、性的にボーカルトレーニングをする前に経験する必要があります。これは、男性のマウントおよび射精までは男性のホームケージに性的受容性の兆候（投げ掛ける、前彎、揺らす耳）を展示している雌ラットを置くことによって達成されます。男性は最初の数セッションの間にマウントされないことがありますと、女性はスニッフィング及び/またはケージの周りの女性を追いかけることで、女性に男性のショーの利益の後に削除される可能性があります。性的経験は、2週間を1日1回行われます。この期間はまた、ラットで実験者（s）とレコーディングルームに慣らすために機会を提供しています。

この方法の1つの制限は、発声タイプの主観的な判断です。各コールが独立して検討し、手動で分類する必要がありますように加えて、この要因は、データ収集の速度を制限します。これに関連して一貫して発声の識別に訓練されている経験豊かな評価者を持つことの重要性です。両方の内と評価者間信頼性は、あなた自身の研究室内で評価されるべきである。

要約すると、げっ歯類の超音波発声は、感情の状態、報酬と中毒、そして自閉症などの疾患状態、を含む、脳と行動の関係を、研究するために多くの異なるモデルで使用されています^。6,14-16この小説の方法は勉強する方法です。加齢とパーキンソン病における音声障害の治療のためのターゲットとボーカルトレーニングのメカニズム。このメソッドは、通信や音声に影響を与える他の疾患モデルに適用される可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101