Summary
מאמר זה מציג cytometry מבוססי זרימת שיטה לחקור את הרכב החיסון של aortas. העיתון גם מדגים טכניקה נוספת המאפשרת לבחון adventitia שמסביב קיר כלי בנפרד. שיטה זו פותחת אפשרויות לבצע ניתוחים phenotypical של לויקוציטים אבי העורקים וליישם מבחני החיסונית מספר מחקרים טרשת עורקים.
Abstract
טרשת עורקים היא תהליך דלקתי כרוני של כלי גודל בינוניים וגדולים אשר מאופיין על ידי היווצרות של פלאק המורכב תאים קצף, תאים של מערכת החיסון, כלי הדם לתאי השריר אנדותל וחלק, טסיות דם, תאי מטריקס, וגרעין שומנים עשירים עם נמק נרחב סיסטיק של הרקמות הסובבות. 1 נשק מולד אדפטיבית של התגובה החיסונית מעורבים בפיתוח ייזום, והתמדה של טרשת עורקים. 2, 3 יש גוף משמעותי של ראיות תת שונים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, דנדריטים תאים לימפוציטים מסוג T ו-B, נמצאים בתוך aortas של עכברים בריאים טרשת עורקים נוטה 4. בנוסף, תאים של מערכת החיסון נמצאים adventitia אבי העורקים המקיפים אשר טוען תפקיד חשוב של רקמת זה atherogenesis 2.
במשך זמן מה, גילוי כמותי של סוגים שונים של תאים חיסוניים, מצב ההפעלה שלהם, את ההרכב התאי בתוך הקיר אבי העורקים היה מוגבל על ידי RT-PCR ושיטות immunohistochemical למחקר של טרשת עורקים. ניסיונות נעשו כדי לבצע cytometry זרימה באמצעות aortas האדם, מספר בעיות, כגון autofluorescence גבוה, דווחו 5,6. פלאק טרשת עורקים האדם היו מתעכל עם collagenase 1, ותאי חינם נאספו מוכתם עבור CD14 + / + CD11c להדגיש macrophage הנגזרות תאים קצף. במחקר זה, ערוץ "מדומה" שימש כדי למנוע חיוביות שגויות מכתים. 6 חומרי נקרוטי המצטבר במהלך תהליך העיכול להצמיח כמות גדולה של פסולת שיוצר autofluorescence גבוהה בדגימות אבי העורקים. כדי לפתור בעיה זו, פאנל של בקרות שלילי וחיובי הוצע, אבל רק מכתים כפול יכול להיות מיושם בדגימות אלה. פיתחנו תזרים חדש cytometry מבוססי שיטה 7 לנתח את ההרכב תא החיסון ולאפיין את ההפעלה, ההפצה, התמיינות של תאים חיסוניים באבי העורקים בריא טרשת עורקים נוטה. שיטה זו מאפשרת את החקירה של הרכב תא החיסון של הקיר אבי העורקים ופותחת אפשרויות לשימוש מגוון רחב של שיטות אימונולוגיות לחקירות היבטים החיסונית של מחלה זו.
Protocol
1. בידוד של aortas Murine
אישור ועדה מוסדית IACUC של ההליך נדרש לעבוד עם עכברים.
- הכן heparinzed PBS על ידי הוספת 1000 יחידות של הפרין סודיום עד 50 מ"ל PBS ואת הצינורית היפוך לערבב. הכן את צינור איסוף ריק בדם צינור המכיל אוסף PBS עבור כל אבי העורקים להיות שנאספו. שמור את כל צינורות על הקרח.
- Heparinize מזרק דם ציור (0.1ml של נתרן U / ml 1000 הפרין), להכין כלים כירורגיים (שני זוגות מלקחיים מעוקל, זוג מספריים לנתח, וזוג microshears), ובמה לנתח לנתיחה.
- להרדים בעכבר באמצעות פחמן דו חמצני בחדר מאושר הבאים NIH ומוסדיים מדיניות הוועדה IACUC לגבי המתת חסד מכרסמים. בדיקת יעילות לפני העברת העכבר לשלב בניתוח.
- בקצרה להשרות את העכבר עם 70% אתנול ו להדק את העכבר על הבמה לנתיחה. צייר דם העכבר באמצעות לנקב לב.
- פתח את החללים הבטן והחזה. בעזרת מזרק 10 מ"ל עם מחט 25 גרם, לחלוטין perfuse vasculature עם PBS המכיל 2% הפרין כדי להסיר לחלוטין את כלי הדם על ידי לנקב לב. ודא כי אין דם בתוך רקמות העורקים. זלוף יש לבצע לאט עם לחץ מעט על מנת להבטיח כי כל פלאק בדפנות כלי הדם נותרו על כנן.
- לנתח ולהסיר את האיברים הקרביים, איברי המין והשתן, הסרעפת והטחול, עוזב את הכליות, הלב, אבי העורקים ללא פגע.
- בזהירות לנתח רקמות השומן ופארא-אבי העורקים בלוטות הלימפה מן האאורטה, והשאיר את אבי העורקים, adventitia ללא פגע. אסוף את כל אבי העורקים כולל קשת אבי העורקים, עולה, יורד, חזה, בטן וחלקים. הנח את העורקים מבודד צינור איסוף עם PBS. במהלך ההליך בבידוד, מנסה לשמור על לחות כלי שיט.
2. הכנת תרחיפים תא בודד
- יצירת אבי העורקים 1X דיסוציאציה אנזימים מניות פתרון (עדס) (125 U / ml collagenase סוג XI, 60 U / ml סוג Hyaluronidase 1-s, 60 U / ml DNase אני, 450 U / ml סוג collagenase אני, 2.5 של ה-MLS PBS, שונה מן גלקינה et al. 7). כל האנזימים של סיגמא אולדריץ. מניחים את האנזים מניות פתרון על הקרח.
- הסר את PBS מהצינור אוסף המכיל את אבי העורקים. הוסף 2.5 מ"ל של 1X עדס על כל אבי העורקים. חותכים את aortas לחתיכות קטנות כדי להקל על עיכול אנזימטי או לעזוב את אבי העורקים כל פגע. דגירה aortas עם פתרון האנזים 1X שעה 1 ב 37 ° C (רועד איטי הוא אופציונלי).
- לאחר דגירה 1 שעה, להכין השעיות תא בודד מתוך האאורטה מעוכל על ידי הגז aortas בנפרד ולהעביר אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך 5 מ"ל FACS צינורות פוליפרופילן (BD פלקון). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (400xg, 5 דקות, 4 ° C).
- Resuspend התאים 1ml של FACS חיץ (PBS BSA בתוספת 1% ו 0.05% NaN 3) ולקבוע כמה תאים נמצאים ההשעיה תא אאורטלי באמצעות trypan כחול, hemocytometer, וכן במיקרוסקופ אור. המספר הכולל של תאים שהושג לאחר העיכול יהיה תלוי גיל עכבר דיאטה או חומרת טרשת עורקים.
3. Cytometry זרימה מכתים
- תווית המספר המתאים של צינורות חדשים FACS. באופן כללי, cytometry ניסויים זרימת צריך צינור שאינו מוכתם שליטה, סדרה של צינורות צבע אחד, מתאים הקרינה מינוס אחד שולט (FMO) 8, שולטת אלוטיפ המתאימים, ומערכת של צינורות ניסיוני. מאחר שיש מספר מוגבל של לויקוציטים אבי העורקים, כי יכול להיות מבודד, leukocytes הטחול ניתן להשתמש כדי לבצע צביעה מלאה אחת.
- אנו משתמשים בפרוטוקול הסטנדרטי cytometry זרימה להכתים השעיות תא אבי העורקים. בקצרה, העברת aliquot של 0.5-1x10 6 תאים ההשעיה תא אבי העורקים לתוך צינור FACS (ים). הוסף 1ml של FACS חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. הסר את supernatant מתאי pelleted באמצעות אחסון.
- הכן פתרון Fc לחסום וקוקטיילים נוגדן עבור צינורות ניסיוני, פלואורסצנציה מינוס אחד צינורות, וצינורות אלוטיפ. הוסף 100μl של Fc לחסום FACS חיץ (14.2μg/ml, לשבט 2.4G2) לכל צינורות בהינף אצבע או מערבולת בעדינות resuspend התאים. דגירה דגימות במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכן מכתים נוגדן, מכתים אלוטיפ או מכתים FMO קוקטיילים שליטה. קביעת ריכוז אופטימלי של נוגדנים בניסויים ראשוניים שלך טיטרציה. בנוכחות לחסום FC, להוסיף קוקטיילים נוגדן (100ul/0.5-1.0x10 6 תאים) על דוגמיות. דגירה של 20-30 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- הוסף 1ml של חיץ FACS על צינור אחד, מערבולת לערבב, ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. חזור על התהליך עוד פעם אחת.
- למזוג supernatant ו resuspendהתאים pelleted ב 300μl PFA של 2%. הפעל את דגימות על cytometer זרימה.
- הערה: בדרך כלל אנטי CD45 נוגדנים (אנטיגן משותף סמן לויקוציטים) מתווסף כל דגימות על מנת שער CD45 + לויקוציטים כעבור 7 בנוסף, CD45 FMO בקרות אלוטיפ יש להשתמש תחילה להציב את השער CD45 + כמו ליקוציט. CD45 הביטוי יכול להשתנות בין לויקוציטים.
- הערה: כדי לזהות צפיפות נמוכה הבעת פני השטח אנטיגנים או אנטיגנים האירוע נמוכה, שימוש "fluorochromes בהיר" כגון R-Phycoerythrin (PE) או Allophycocyanin (APC). בנוסף, אירועים נדירים ניתן להבחין באמצעות איגום aortas מתאימים כמה יחד, אך אם יותר ממיליון תאים רגילים, כמות הנוגדנים המשמשים לכל מבחן צריך להיות גדל באופן פרופורציונלי.
- הערה: על מנת להבטיח כי יש זיהומים בדם מינימלי aortas מבודד ולכן ההשעיה התא אבי העורקים, בניסויים מסוימים מכתים נוסף בוצע עבור TER-119, 7 אנטיגן לידי ביטוי בתאי הדם האדומים (RBC). מספר RBC את כדוריות הדם הלבנות (WBC) בדם הוא בערך 10x10 6 תאים / μl לתא 8x10 3 / μl. בהתבסס על הביטוי של TER-119 בדגימות אבי העורקים, אחוז דם שמקורם בתאי הדם הלבנים במדגם יכול להיות מחושב. בדרך כלל יש לנו פחות 0.02% דם הנגזרות WBC בדגימות אבי העורקים. (תמונה 1)
- הערה: מאחר טיפול האנזים עלול להשפיע על ביטוי של אנטיגנים פני השטח, את ההתנגדות העיכול אנזים יש לקבוע עבור אנטיגנים של עניין. בקצרה, הלימפה ההיקפית (PLN) או חתיכות קטנות של הטחול מודגרת עם או בלי קוקטייל האנזים במשך שעה 1 ב 37 ° C. אחרי שעה 1, ביטוי של אנטיגנים נקבעת על ידי cytometry הזרימה. קוקטייל אנזים אין כל השפעה על פני השטח אנטיגנים מרובים (Fig.2) 7. במקרים אחרים, הטיפול אנזים לאובדן משמעותי של הבעת אנטיגן. בעיה זו ניתן לעקוף באמצעות סמנים תא חלופי.
- שים לב: חי / מת הכדאיות מכתים התא יכול להתבצע לאחר שלב 4 אם תרצה בכך. בדרך כלל משתמשים Live / Dead Cell ניתן לתקן ערכת המלח כתמים (Invitrogen, בדיקות מולקולריות). כדי להכתים את התאים עם צבע חי / מת, ליצור פתרון Live / Dead 1x ידי הוספת 1μl של לצבוע מחדש מומס חי / מת 1ml של PBS ו מערבולת לערבב. הוסף 100-200 μl של צבע 1x Live / המלח קוקטייל חי / מת, בודד, FMO דגימות אלוטיפ שליטה. דגירה דגימות עם צבע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. צינור בקרה יחיד עבור Live / Dead צריך להיות מודגרות ב 56 ° C בחושך במשך 10 דקות כדי להרוג את התאים על ידי הלם חום. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ו גלולה התאים על ידי צנטריפוגה. המשך בפרוטוקול על שלב 5.
- הערה: מכתים תאיים עבור אנטיגנים ו ציטוקינים תאיים תואם פרוטוקול זה. בקצרה, מכתים תאיים יכול להתבצע באמצעות קיבוע תא / ריאגנטים permeabilization מ BD Pharmingen, eBioscience, או Caltag מעבדות - תלוי את האנטיגנים של עניין. כדי לתקן permeabilize התאים עבור מכתים תאיים, לבצע את הצעד קיבעון / permeabilization, בעקבות הוראות היצרן, לאחר השלב מכתים תאית (3 צעד סעיף 5). בעקבות הצעד לשטוף תאיים, לחדש את פרוטוקול שלנו בכל שלב 6 (3 בסעיף צעד 6).
4. Cytometry זרימה ניתוח adventitia שמסביב מבודדים כלי הקיר
כפי leukocytes יכול להעביר את adventitia אבי העורקים, כמו גם משקעים של טרשת העורקים בתוך הקיר, כדי לבחון leukocytes adventitial ואת אבי העורקים על ידי זרימת cytometry פרוטוקול לבידוד וביצוע cytometry זרימה על שני אתרי אנטומי פותחה. 9 בקצרה, לפני כל aortas מתעכלים עם עדס (סעיף 2, שלב 2) adventitia אבי העורקים הוא מעוכל חלקית והוציאו משאר כלי השיט. לאחר adventitia מוסר ומניחים בצד, שאר האאורטה מתעכל עם עדס לשחרר leukocytes מהקיר כלי.
- אבי העורקים Adventitia בידוד פרוטוקול
- בעקבות הכנת 1X עדס (2 סעיף צעד 1), להכין 2.5 מ"ל / אבי העורקים של 1X פתרון אבי העורקים adventitia העיכול אנזים (AADES) (781.25 U collagenase השנייה 14.0625 U Elastase ב 2.5mls PBS (וורטינגטון קורפ ביוכימיים, לייקווד, ניו ג'רזי )). 9 מקום הפתרון המניות על הקרח עד לשימוש.
- הסר את PBS מהצינור אוסף המכיל את אבי העורקים. הוסף 2.5 מ"ל של 1X AADES אל אבי העורקים בכל. אין לחתוך את aortas לחתיכות קטנות. דגירה aortas עם פתרון האנזים 1X adventitia במשך 10-20 דקות על 37 ° C.
- בעקבות העיכול 10-20 דקות, להעביר את אבי העורקים מעוכל חלקית מתוך 1X AADES כדי בצלחת פטרי עם PBS טריים. בזהירות רבה, באמצעות שני זוגות מלקחיים מעוקל, לקלף את שכבת adventitial משם frאום אבי העורקים כיחידה אחת.
- הערה: פעמים עיכול ארוך יותר להקל להסיר את adventitia, אולם אם adventitia הוא מעל מתעכל זה יקרע.
- כאשר adventitia הוסר לחלוטין, להעביר את adventitia ואת אבי העורקים לצינורות FACS נפרד. הוסף 1ml של PBS על הצינור adventitia, והמקום צינור על הקרח. הוסף 2.5 MLS של 1X פתרון האאורטה ניתוק אנזים אל הצינור באבי העורקים דגירה אבי העורקים במשך 40 דקות על 37 ° C.
- הערה: כדי להקל על עיכול אנזימטי, אבי העורקים ניתן לחלק לחתיכות קטנות בשלב זה.
- בעקבות העיכול 40 דקות, במקום צינור אבי העורקים על הקרח ולהכין השעיות תא בודד מתוך אבי העורקים ואת adventitia על ידי הגז aortas ו adventitia בנפרד ולהעביר אותם דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך תא 5 מ"ל FACS צינורות פוליפרופילן (BD פלקון). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (400xg, 5 דקות, 4 ° C). חזור אל 4 סעיף 2 צעד ולחדש את הפרוטוקול.
5. נציג תוצאות
כאן אנו מציגים מספר דמויות מדגים cytometry זרימה מכתים לנתח את הרכב החיסון של aortas שלם, הקיר אבי העורקים ואת כלי adventitia אבי העורקים שמסביב. ראשית, עלינו להוכיח מזימה נציג FACS המציג מכתים-119 TER על דם כולו העורקים תא מבודד ההשעיה (איור 1). TER-119 תאים חיובי דם אדומות היוו 18% של התאים ההשעיה תא אבי העורקים, אשר מציין כי רק 0.014% של תאים מבודדים השעיות תא העורקים הם דם הנגזרות. זהו ניסוי חשוב לשלוט מדגים בבירור כי כלי מתעכל, אך לא במחזור הדם ההיקפיים היא המקור לרוב leukocytes לנתח ההשעיה תא אבי העורקים. בנוסף, כדי לאמת את השיטה, אנו להעריך את ההשפעות של קוקטייל אבי העורקים אנזים דיסוציאציה אנטיגנים על פני השטח splenocyte (איור 2). קוקטייל האנזים אין השפעות על ביטוי של אנטיגנים שונים, וביניהם, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ וכמה אנטיגנים פני אחרים 7.
CD45 מכתים בשיתוף עם צבע חי / מת הכדאיות בקרות אלוטיפ המתאימים המשמשים לאיתור ותת שער האוכלוסיות הגדולות של עניין להוציא פסולת הסלולר במהלך ניתוח. בתוך אבי העורקים, Fig.3 לחיות CD45 + לויקוציטים היו סגורות על מנת לקבוע את האחוז של IFN Υ + T תאים בתוך aortas ונקווה ApoE של שני צעירים - / - עכברים. כדי להדגיש את הרבגוניות של שיטה זו, באמצעות סכימת gating שהוצגו Fig.3, אנו נוכחים מכתים Fig.4 תאיים נציג CD68 + + CD11b מאקרופאגים IFNγ TCRαβ + + תאים ApoE שני - / - העכברים שהוזנו בתזונה המערבית עבור 12 שבועות. כצפוי, במערב דיאטה נמאס ApoE - / - aortas, רוב leukocytes בתוך אבי העורקים הם מקרופאגים (40% + CD68 CD11b +) או תאים מיאלואידית אחרים (CD11b + CD68 נמוך CD11b + CD68-). בנוסף, Th1 התאים מהווים חלק נכבד של אבי העורקים חדירה לתאי T TCRαβ (Fig.4). ככל האחוז הכולל של לויקוציטים אבי העורקים ואת תת ליקוציט משתנה בהתאם לגילו של העכבר והחומרה של טרשת עורקים, האסטרטגיה gating אופטימלי לאוכלוסיות הגדולות של עניין יש לקבוע באופן אמפירי
כדי להוכיח את ההיתכנות של בידוד adventitia אבי העורקים עבור מכתים cytometry זרימה, אנו מציגים נציג CD45 + מכתים ליקוציט עבור השעיות תא אבי העורקים adventitial (איור 5). בקצרה, שלושה ApoE בני - / - aortas עכבר היו מתעכל ונקווה יחד כמתואר לעיל (סעיפים 2 ו - 4). חדירה CD45 לויקוציטים + התגלו גם adventitia (18% ההשעיה התא) לבין אבי העורקים הנותרים (11% ההשעיה התא).
1. איור TER-119 מכתים ההשעיה מתעכל תא אבי העורקים. העורקים היה perfused ידי לנקב לב עם PBS המכילה הפרין 2%. ואז אבי העורקים היה מתעכל עם קוקטייל האנזים עבור שעה 1 ב 37 ° C. ההשעיה תאים אבי העורקים ואת דגימת דם (כביקורת חיובית) הוכתמו אנטי TER-119-PE Abs ונותחו על ידי cytometry הזרימה. TER-119-חיובי דם תאים אדומים החשבון עבור 18% של כל התאים ההשעיה תא העורקים המעיד כי רק 0.014% מכלל leukocytes מבודד aortas צפויים להיות דם הנגזרות לויקוציטים.
איור 2. אנזימים קוקטייל לטיפול אין תופעות על CD45 (למעלה) או CD19 (התחתון) ביטוי על לימפוציטים. + / CD19 + לימפוציטים. פרופילים אלה מגודרת על לויקוציטים + CD45.
איור 3 אסטרטגיה gating לניתוח leukocytes אבי העורקים שני aortas בודדו ונקווה מ ApoE נוטה טרשת עורקים -.. / - עכברים השעיות תא העורקים היו מוכנים כפי שתואר לעיל. המתלים התא היו מוכתמים עבור CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), ו-Live / Dead אקווה, ונותחו באמצעות DXP Cytek 8 צבע לשדרג BD FACS Calibur. בקצרה, CD45 + Leukocytes היו סגורות (B) ניתח נוסף (CF). תאים מתים הוצאו מן הניתוח מבוסס על מכתים Live / Dead אקווה (ד ') ומגרשים FSC (E). חיים leukocytes אבי העורקים שנבדקו אז על TCRαβ ו IFNγ הביטוי (F).
.. השעיות Cell איור 4 מכתים תאיים עבור אנטיגנים ו ציטוקינים תאיים היו מוכנים מן ApoE שלם - / - אבי העורקים והטחול כמתואר. אבי העורקים (א) ו השעיות תא הטחול (B, C) היו מוכתמים עבור CD45, CD11b ו CD68 או פקד אלוטיפ באמצעות BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). תאים היו סגורות על לויקוציטים + CD45 ופסולת הוצא על סמך פרופילים פיזור קדימה בצד. עבור מכתים IFNγ תאיים, השעיות תא העורקים ואת הטחול היו בתרבית במשך חמש שעות RPMI 1640 בתוספת Golgi לעצור, PMA, ו Ionomycin C, כמתואר לעיל. 9 מגורה אבי העורקים אחד (D) הטחול (E, F) השעיות תא היו מוכתם לאחר מכן עם CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), חי אקווה המלח, IFNγ (eFluor 450, E) או אלוטיפ (IgG1-eF450, F). ותאי T (DF) היו מגודרת מפני לחיות CD45 + CD3 + לויקוציטים (CD45 + Live / Dead אקווה) ובחן עבור TCRαβ ו IFNγ.
.. איור 5 תמונה נציג בודד העורקים adventitia Murine קיר העורקים כלי תזרים נציג cytometry העלילה נגד מדגים את נוכחותם של + CD45 בתאי T של adventitia ואת אבי העורקים הקיר של ApoE בני - / - עכברים. SSC בצד פיזור. כדי למנוע autofluorescence מן ההריסות ורקמות נמקי, מגרשים היו מגודרת עבור FSC> 750. כדי למנוע כפילויות autofluorescence נוספים השערים הוקמו כמו FSC <3500, SSC <3500. אחוזי עולה CD45 + תאים בתוך השערים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה זרימה cytometry מבוססי לחקירה של הרכב של תא החיסון aortas Murine. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לנתח תאים חיסוניים אבי העורקים בכל הרמות תא בודד כדי לאפיין את מצב ההפעלה של לויקוציטים אבי העורקים. שיטה זו אינה מוגבלת aortas Murine ואנחנו (נתונים שלא פורסמו) ועוד 10 השתמשו בגישה זו כדי לנתח דגימות אנושיות כגון עורק השד הפנימי, שסתומי העורקים ואת העורקים הכליליים. מגבלה אחת של שיטה זו הוא המספר הנמוך יחסית של לויקוציטים אבי העורקים Murine התאושש aortas יחיד. בעוד מספר לויקוציטים התאושש אבי העורקים טרשת עורקים אחת מספיקה עבור ניסוי cytometry זרימה, התאים אשר נמוכים בשפע עלול להיות קשה לזהות בתוך אבי העורקים ההשעיה תא בודד. אם יש צורך, בעיה זו ניתן לעקוף באמצעות דגימות בשילוב 2-4 aortas עבור מכתים cytometry הזרימה. בנוסף, מאז הטיפול האנזים עלול להשפיע על ביטוי של אנטיגנים פני השטח, ההתנגדות לטיפול אנזים יש לקבוע עבור כל אנטיגנים של עניין. יש לנו תוקף בעבר מספר סמנים אנטיגן, אשר אינם מושפעים על ידי עיכול אנזימטי 7. עם זאת, שיבוטים נוגדן נבדק צריך להיות מאומת על ידי החוקר לפני בשימוש cytometry ניסויים תזרים 7.
העברת תחרותי assay המאמצת ביות היא שיטה חזקה כדי לנתח את קינטיקה ומנגנונים של גיוס לויקוציטים לאתר של דלקת. אנו ליישם בהצלחה cytometry זרימה ניתוח aortas מעכברים הנמען לחקור את המנגנון של הגירה ליקוציט את aortas. 7 על מנת לנתח את התאים התרבו לאחרונה, שילוב של bromodeoxyuridine (BrdU) in vivo יכול לשמש כסמן מצוין עבור תאים מתרבים. אנו להחיל את הטכניקה הזו עם ניתוח תזרים cytometry הבאים כדי לזהות אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T של העכברים aortas של הנמען. 7
ישנו גוף הולך וגדל של עדויות המצביע על כך adventitia אבי העורקים ממלא תפקיד חשוב ב atherogenesis. מכתים immunohistochemical של aortas עם adventitia המקיף מספק נתונים חיוניים על לוקליזציה ליקוציט בתוך הרקמות לנתח, אבל יש כמה מגבלות אפיון מפורט של subpopulations ליקוציט. פיתחנו שיטה המבוססת cytometry הזרימה המאפשר ניתוח של האאורטה והסביבה adventitia בנפרד 9 טכניקה זו מרגש חדש cytometry מבוססי זרימת, בשילוב עם היסטולוגיה ומבוססת מולקולרית המבוססת על טכניקות, יסייע לזהות הבדלים אפשריים phenotypical ו מאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים המתגוררים adventitial קיר כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק: PO1 HL55798 (כדי KL) ו - American Heart Association המדען פיתוח גרנט 0525532U (אל למשל).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNase I, type 2 | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase II | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002292 |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
- Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
- Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
- Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
- Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
- Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).
