Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Summary

Dit document presenteert een flow cytometrie-gebaseerde methode om het immuunsysteem samenstelling van de aorta's te onderzoeken. De paper illustreert ook een extra techniek die het mogelijk maakt te onderzoeken omringende adventitia en vaatwand afzonderlijk. Deze methode biedt mogelijkheden om fenotypische analyses van de aorta leukocyten uit te voeren en een aantal immunologische testen toe te passen voor atherosclerose studies.

Abstract

Atherosclerose is een chronisch ontstekingsproces van middelgrote en grote schepen die wordt gekenmerkt door de vorming van plaques bestaande uit schuimcellen, immuuncellen, vasculaire endotheliale en gladde spiercellen, bloedplaatjes, extracellulaire matrix, en een lipide-rijke kern met uitgebreide necrose en fibrose van de omliggende weefsels. ¹ De aangeboren en adaptieve armen van de immuunrespons betrokken zijn bij de initiatie, ontwikkeling en voortbestaan ​​van atherosclerose. ^{2, 3} Er is een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat verschillende subgroepen van de immuun cellen, zoals macrofagen, dendritische cellen, T-en B-lymfocyten, zijn aanwezig in de aorta's van gezonde en atherosclerose-gevoelige muizen ^4. Daarnaast worden immuuncellen in de omliggende aorta adventitia, die een belangrijke rol van dit weefsel suggereert in atherogenese ^2.

Al enige tijd werd de kwantitatieve detectie van verschillende soorten immuuncellen, de activatie-status, en de cellulaire samenstelling binnen de aorta beperkt door de RT-PCR en immunohistochemische methoden voor de studie van atherosclerose. Er zijn maar weinig pogingen werden ondernomen om flowcytometrie met behulp van menselijke aorta uit te voeren, en een aantal problemen, zoals een hoge autofluorescentie, zijn gemeld ^5,6. Human atherosclerotische plaques werden verteerd met collagenase 1, en vrije cellen werden verzameld en gekleurd voor CD14 + / + CD11c tot macrofaag-afgeleide schuimcellen te markeren. In deze studie werd een 'mock "kanaal gebruikt om vals-positieve kleuring te vermijden. ⁶ necrotische materiaal accumuleren tijdens het verteringsproces leiden in een grote hoeveelheid puin dat een hoge autofluorescentie bij aorta-monsters genereert. U lost dit probleem, heeft een panel van negatieve en positieve controles voorgesteld, maar slechts twee kleuren kan worden toegepast in deze monsters. We hebben een nieuwe flow cytometrie-gebaseerde methode ⁷ om het immuunsysteem cel samenstelling te analyseren en te karakteriseren de activatie, proliferatie, differentiatie van immuuncellen in gezonde en atherosclerose-gevoelige aorta. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek van de immuun cel samenstelling van de aorta en opent mogelijkheden om een ​​breed spectrum van immunologische methoden voor het onderzoeken van het immuunsysteem van aspecten van deze ziekte.

Protocol

1. Isolatie van muizen aorta

Institutionele IACUC commissie goedkeuring van de procedure is nodig om te werken met muizen.

1. Bereid heparinzed PBS door het toevoegen van 1.000 eenheden heparine natrium tot 50 ml PBS en omdraaien van de buis te mengen. Bereid een lege collectie buis voor het bloed en een verzameling buis met PBS voor elke aorta te worden verzameld. Houd alle buizen op ijs.
2. Heparinize een injectiespuit voor het tekenen van bloed (0,1 ml van 1000 U / ml Heparine natrium), voor te bereiden chirurgische instrumenten (twee paren van gebogen pincet, een paar ontleden schaar, en een paar microshears), en een dissectie podium voor de dissectie.
3. Euthanaseren een muis met behulp van kooldioxide in een goedgekeurde kamer na NIH en Institutionele IACUC commissie beleid ten aanzien van euthanasie knaagdier. Controleren op effectiviteit alvorens de muis om het ontleden podium.
4. Kort genieten van de muis met 70% ethanol en zet de muis om de dissectie podium. Teken het bloed van de muis via de cardiale punctie.
5. Open de buik-en borstholte. Met behulp van een 10 ml spuit met een 25 g naald, volledig perfuseren het vaatstelsel met PBS met 2% van heparine volledig bloed te verwijderen uit de schepen door het hart doorboren. Zorg ervoor dat er geen bloed in de aorta weefsels. De perfusie moet langzaam worden uitgevoerd met weinig druk om ervoor te zorgen dat alle plaques in de vaatwand intact blijven.
6. Ontleden en verwijder de viscerale organen, urogenitale organen, diafragma en milt, waardoor de nieren, het hart en aorta intact.
7. Zorgvuldig te ontleden vetweefsel en para-aortale lymfeklieren uit de buurt van de aorta, waardoor de aorta en adventitia intact. Verzamel de gehele aorta inclusief aortaboog, oplopende, aflopende, thoracale en abdominale porties. Plaats het geïsoleerde aorta in een verzameling buis met PBS. Tijdens de isolatie procedure, probeer het schip vochtig te houden.

2. De voorbereiding van enkele celsuspensies

1. Maak een 1X Aorta Dissociatie Enzyme-stamoplossing (ADES) (125 U / ml Collagenase type XI, 60 U / ml hyaluronidase type 1-s, 60 U / ml DNase I, en 450 U / ml Collagenase type I, in 2,5 ml van PBS, gewijzigd bij Galkina et al.. ^7). Alle enzymen zijn van Sigma-Aldrich. Leg de voorraad enzymoplossing op ijs.
2. Haal de PBS uit de collectie buis met de aorta. Voeg 2,5 ml 1X ADES aan elke aorta. Snijd de aorta's in kleine stukjes voor enzymatische vertering te vergemakkelijken of het gehele aorta intact laten. Incubeer de aorta met de 1X enzym oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C (langzamer schudden is optioneel).
3. Na de 1 uur incubatie, bereiden enkele cel schorsingen van de aorta verteerd door knippen van de aorta's van elkaar en ze door te geven door middel van een 70 micrometer cel zeef in 5 ml polypropyleen buizen FACS (BD Falcon). Pellet de cellen door centrifugeren (400xg, 5 minuten, 4 ° C).
4. Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS buffer (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,05% NaN ₃₎ en bepalen hoeveel cellen aanwezig zijn in de aorta celsuspensie met behulp van trypan blauw, een hemocytometer, en een lichtmicroscoop. Het totale aantal cellen verkregen na de spijsvertering zal afhangen van de muis leeftijd en voeding of de ernst van atherosclerose.

3. Flowcytometrie vlekken

1. Label een passend aantal nieuwe FACS buizen. In het algemeen moeten flow cytometrie experimenten hebben een niet-gekleurde controle buis, set van een kleur buizen, geschikt fluorescentie-minus-een-controles (FMO) ^8, passende isotype controles, en een set van experimentele buizen. Aangezien er een beperkt aantal aorta leukocyten die kunnen worden geïsoleerd, kan de milt leukocyten worden gebruikt om enkele controle vlekken uit te voeren.
2. We maken gebruik van een standaard protocol om flowcytometrie aorta celsuspensies vlek. Kortom, de overdracht een portie van 0,5-1x10 ⁶ cellen van een aorta-celsuspensie in een FACS buis (s). Voeg 1 ml FACS buffer en pellet van de cellen door centrifugeren. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het ingehulde cellen door decanteren.
3. Bereid Fc blok oplossing en antilichaam cocktails voor de experimentele buizen, fluorescentie-minus-een-buizen, en isotype buizen. Voeg 100μl van Fc blok in FACS buffer (14.2μg/ml, kloon 2.4G2) om alle van de buizen en vinger flick of zacht vortex om de cellen te mengen. Incubeer de monsters gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
4. Bereid antilichaam kleuring, isotype vlekken of FMO controle vlekken cocktails. Bepaal de optimale concentratie van antilichamen in uw voorlopige titratie-experimenten. In aanwezigheid van Fc blokkeren, toe te voegen antilichaam cocktails (100ul/0.5-1.0x10 ⁶ cellen) aan het monster buizen. Incubeer 20-30 min bij 4 ° C in het donker.
5. Voeg 1 ml FACS buffer aan elke buis, om Vortex, en pellet de cellen door centrifugeren. Herhaal de procedure nog een keer.
6. Giet het supernatant en resuspendeerhet ingehulde cellen in 300μl van 2% PFA. Voer de monsters op een flowcytometer.
   • Let op: Typisch anti-CD45 antilichaam (gemeenschappelijke leukocyten antigen marker) wordt toegevoegd aan alle van de monsters om de gate CD45 ⁺ leukocyten later ⁷ Bovendien, CD45 FMO en isotype controles moeten in eerste instantie worden gebruikt om de CD45 ⁺ leukocyten poort plaats. CD45 expressie kan variëren tussen leukocyten.
   • Opmerking: Om met lage dichtheid uiten van oppervlakte-antigenen of lage evenement antigenen te detecteren, "helder fluorochromen", zoals R-phycoerythrin (PE) of Allophycocyanin (APC). Daarnaast kunnen zeldzame gebeurtenissen worden gedetecteerd door het samenbrengen van verschillende afgestemd aorta's bij elkaar, maar als er meer dan een miljoen cellen worden gebruikt, de hoeveelheid antilichamen die per test moet evenredig verhoogd.
   • Opmerking: Om ervoor te zorgen dat er minimaal bloed verontreinigingen in de geïsoleerde aorta en dus ook in de aorta celsuspensie, in sommige experimenten extra kleuring werd uitgevoerd voor TER-119, ⁷ een antigen uitgedrukt door rode bloedcellen (RBC). Het aantal RBC aan witte bloedcellen (WBC) in het bloed is ongeveer 10x10 ⁶ cell / ul tot 8x10 ³ cellen / ul. Op basis van de expressie van TER-119 bij aorta-monsters, kan het percentage van de op basis van bloed witte bloedcellen in het monster worden berekend. Typisch hebben we minder dan 0,02% van de op basis van bloed WBC bij aorta-monsters. (Fig.1)
   • Let op: Omdat het enzym behandeling kan de uitdrukking van oppervlakte-antigenen van invloed zijn, de weerstand tegen enzymdigestie moet worden bepaald voor de antigenen van belang. Kortom, zijn perifere lymfeknoop (PLN) of kleine stukjes milt geïncubeerd met of zonder enzym cocktail gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na 1 uur, is de uitdrukking van antigenen bepaald door flowcytometrie. Het enzym cocktail heeft geen effect op meerdere oppervlakte-antigenen (Fig.2) ^7. In sommige andere gevallen, het enzym behandeling resulteerde in een aanzienlijk verlies van antigeen expressie. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van alternatieve cel markers.
   • Let op: Live / dead levensvatbaarheid van de cellen verkleuring kan worden uitgevoerd na stap 4 indien gewenst. Gebruiken meestal Live / Dead Muur Dead Cell Stain kit (Invitrogen, Molecular Probes). Om vlekken op de cellen met Live / Dead kleurstof, maak dan een 1x Live / Dead-oplossing door het toevoegen van 1μl opnieuw opgelost live / dood kleurstof in 1 ml PBS en vortex te mengen. Voeg 100 tot 200 ul van 1x Live / Dead kleurstof naar de live / dode single, cocktail, FMO en isotype controle monsters. Incubeer de monsters met de kleurstof bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. De single controle buis voor Live / Dead moet worden geïncubeerd bij 56 ° C in het donker gedurende 10 minuten naar de cellen te doden door hitte shock. Was de cellen met 1 ml PBS en pellet van de cellen door centrifugeren. Hervat het protocol bij stap 5.
   • Let op: Intracellulaire kleuring voor intracellulaire antigenen en cytokines is compatibel met dit protocol. Kortom, kan intracellulaire kleuring worden uitgevoerd met behulp van cel-fixatie / permeabilisatie reagentia van BD Pharmingen, eBioscience, of Caltag laboratoria - afhankelijk van de antigenen van belang. Vast te stellen en permeabilize de cellen voor intracellulaire kleuring, voert u de fixatie / permeabilisatie stap, volgens de instructies van de fabrikant, na de extracellulaire vlekken stap (hoofdstuk 3, stap 5). Naar aanleiding van de intracellulaire wasstap, hervatten ons protocol bij stap 6 (hoofdstuk 3 stap 6).

4. Flowcytometrie-analyse van geïsoleerde omgeving adventitia en vaatwand

Zoals leukocyten kunnen migreren naar de aorta adventitia als atherosclerotische plaques in de aorta, naar adventitia en aorta leukocyten te onderzoeken door middel van flowcytometrie een protocol voor het isoleren en het uitvoeren van flowcytometrie op deze twee anatomische sites werd ontwikkeld. ^Negen kort, voor de gehele aorta worden verteerd met ADES (hoofdstuk 2, stap 2) van de aorta adventitia is gedeeltelijk verteerd en verwijderd van de rest van het schip. Zodra de adventitia is verwijderd en vernietigd, is de rest van de aorta verteerd met ADES naar leukocyten te bevrijden van de vaatwand.

• Aorta adventitia Isolatie Protocol

1. Naar aanleiding van de voorbereiding van 1X ADES (deel 2 stap 1), voor te bereiden 2,5 ml / aorta van 1X Aorta adventitia spijsvertering enzym-oplossing (AADES) (781.25 U Collagenase II en 14.0625 U Elastase in 2.5mls PBS (Worthington biochemische Corp, Lakewood, NJ )). ⁹ Plaats de stockoplossing op ijs tot gebruik.
2. Haal de PBS uit de collectie buis met de aorta. Voeg 2,5 ml 1X AADES aan elke aorta. Knip niet de aorta's in kleine stukjes. Incubeer de aorta met de 1X adventitia enzymoplossing gedurende 10-20 minuten bij 37 ° C.
3. Na de 10-20 minuten spijsvertering, de overdracht van de gedeeltelijk verteerde aorta uit het 1x AADES om een ​​petrischaal met verse PBS. Heel voorzichtig, gebruik van twee paar gebogen pincet, schil de adventitia laag weg frOM de aorta als een eenheid.
   • Let op: langere digestietijden maken het makkelijker om de adventitia te verwijderen, maar als de adventitia is over-verteerd zal scheuren.
4. Als de adventitia volledig is verwijderd, de overdracht van de adventitia en de aorta te scheiden FACS buizen. Voeg 1 ml PBS op de adventitia buis, en plaats de buis op het ijs. Voeg 2,5 ml van 1X aorta dissociatie enzym oplossing voor de aorta buis en incubeer de aorta gedurende 40 minuten bij 37 ° C.
   • Opmerking: Om de enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken, de aorta kan worden verdeeld in kleinere stukken op dit punt.
5. Na de 40 minuten spijsvertering, plaats de aorta buis op ijs en voor te bereiden single cell schorsingen van de aorta en de adventitia door knippen van de aorta en de adventitia van elkaar en ze door te geven door middel van een 70 micrometer cel zeef in 5 ml polypropyleen buizen FACS (BD Falcon). Pellet de cellen door centrifugeren (400xg, 5 minuten, 4 ° C). Ga terug naar hoofdstuk 2 stap 4 en hervat het protocol.

5. Representatieve resultaten

Hier presenteren wij een aantal figuren die flowcytometrie vlekken om het immuunsysteem samenstelling van de gehele aorta, de aorta vaatwand en de omringende aorta adventitia analyseren laat zien. Eerst tonen we een vertegenwoordiger FACS plot dat een TER-119 vlekken op de vol bloed en geïsoleerd aorta celsuspensie (afb. 1) toont. TER-119 positieve rode bloedcellen goed voor 18% van de cellen in de aorta celsuspensie, wat aangeeft dat slechts 0,014% van de cellen geïsoleerd uit aorta celsuspensies zijn op basis van bloed. Dit is een belangrijk controle-experiment dat duidelijk aantoont dat verteerd schepen, maar niet circulerende perifeer bloed is de bron voor de meeste leukocyten geanalyseerd in de aorta celsuspensie. Daarnaast is het valideren van de methode, onderzochten we de effecten van de aorta dissociatie enzym cocktail op splenocyten oppervlakte-antigenen (afb. 2). Het enzym cocktail heeft geen effect op de expressie van verschillende antigenen, met inbegrip van, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ en diverse andere oppervlakte-antigenen ^7.

CD45 kleuring in combinatie met Live / Dead levensvatbaarheid dye en passende isotype controles worden gebruikt voor het detecteren en sub-gate grote populaties van belang en de cellulaire puin uit te sluiten tijdens de analyse. In de Fig.3, live aorta-CD45 ⁺ leukocyten waren gated om het percentage van de IFN bepalen _Υ + T-cellen in de gepoolde aorta's van twee jonge ApoE ^{- / -} muizen. Om te benadrukken de veelzijdigheid van deze methode, met behulp van de gating schema in figuur 3, presenteren we in Fig.4 representatief intracellulaire kleuring voor CD68 + CD11b + macrofagen en IFNy + TCRαβ + cellen van twee ApoE ^{- / -} muizen gevoed westerse dieet voor 12 week. Zoals verwacht, in het westen van dieet gevoed ApoE ^{- / -} aorta, de meerderheid van de leukocyten in de aorta zijn macrofagen (40% CD68 + CD11b +) of andere myeloïde cellen (CD68 + CD11b ^laag en CD11b + CD68-). Daarnaast, Th1-cellen bestaan ​​uit een groot deel van de aorta infiltrerende TCRαβ T-cellen (Fig.4). Als het totale percentage van de aorta leukocyten en leukocyten subsets varieert afhankelijk van de leeftijd van de muis en de ernst van atherosclerose, moet de optimale gating strategie voor grote populaties van belang empirisch worden bepaald

Om aan te tonen de haalbaarheid van het isoleren van de aorta adventitia voor flowcytometrie kleuring, presenteren wij vertegenwoordiger CD45 ⁺ leukocyten kleuring voor aorta-en adventitia celsuspensies (figuur 5). Kortom, drie jaar ApoE ^{- / -} muis aorta waren verteerd en samen gebundeld zoals hierboven beschreven (punten 2 en 4). Infiltreren CD45 ⁺ leukocyten werden ontdekt in zowel de adventitia (18% van de celsuspensie) en de resterende aorta (11% van de celsuspensie).

Figuur 1. TER-119 kleuring in verteerd aorta celsuspensie. Aorta werd geperfuseerd door hart doorboren met PBS met 2% heparine. Dan is de aorta werd gedigereerd met het enzym cocktail gedurende 1 uur bij 37 ° C. Aorta cellen schorsing en bloedmonster (als een positieve controle) werden gekleurd met anti-TER-119-PE Abs en geanalyseerd door flowcytometrie. TER-119-positieve rode bloedcellen goed zijn voor 18% van alle cellen in de aorta celsuspensie geeft aan dat slechts 0,014% van alle leukocyten geïsoleerd uit aorta's zijn waarschijnlijk op basis van bloed leukocyten.

Figuur 2. Enzyme-cocktail behandeling heeft geen effect op CD45 (boven) of CD19 (onder) expressie op lymfocyten. + / CD19 ⁺ lymfocyten. Profielen zijn gated op CD45 ⁺ leukocyten.

Figuur 3 Gating strategie voor de analyse van de aorta leukocyten twee aorta's werden geïsoleerd en samengevoegd uit atherosclerotische gevoelige ApoE.. ^{- / -} Muizen en aorta cel suspensies werden bereid zoals hierboven beschreven. De cel suspensies werden gekleurd voor CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNy (eFluor 450), en Live / Dead Aqua, en geanalyseerd met behulp van een Cytek DXP 8 Kleur opgewaardeerd BD FACS Calibur. Kortom, CD45 ⁺ Leukocyten waren gated (B) en verder geanalyseerd (CF). Dode cellen werden verwijderd uit de analyse op basis van Live / Dead Aqua kleuring (D) en FSC percelen (E). Live-aorta leukocyten werden vervolgens onderzocht op TCRαβ en IFNy expressie (F).

.. Figuur 4 intracellulaire kleuring voor intracellulaire antigenen en cytokines Cell suspensies werden bereid uit een hele ApoE ^{- / -} aorta en de milt zoals beschreven. Aorta (A) en milt (B, C) celsuspensies werden gekleurd voor CD45, CD11b en CD68 of een isotype controle met behulp van BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). Cellen werden gated op CD45 ⁺ leukocyten en het puin werd uitgesloten op basis van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing profielen. Voor intracellulaire IFNy kleuring, aorta en de milt cel suspensies werden gekweekt voor vijf uur in RPMI 1640 aangevuld met Golgi stoppen, PMA, en ionomycine C, zoals eerder beschreven. ^Negen Gestimuleerd single aorta (D) en milt (E, F) cel suspensies werden vervolgens gekleurd met CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Dead Aqua, en IFNy (eFluor 450, E) of een isotype (IgG1-eF450, F). T-cellen (DF) werden gated van levende CD45 + CD3 + leukocyten (CD45 + Live / Dead Aqua-) en onderzocht op TCRαβ en IFNy.

.. Figuur 5 representatief beeld van de geïsoleerde muizen aorta adventitia en aorta vaatwand vertegenwoordiger flowcytometrie teller plot toont de aanwezigheid van CD45 ⁺ T-cellen in de adventitia en de aorta van de leeftijd van ApoE ^{- / -} muizen. SSC-zijwaartse verstrooiing. Te elimineren autofluorescentie van puin en necrotische weefsels, plots werden gated voor FSC> 750. Om te voorkomen dat extra autofluorescentie van doubletten de poorten werden ook opgezet als FSC <3500, SSC <3500. De percentages geven CD45 ⁺ cellen in de poorten.

Discussion

Hier presenteren wij een flow-cytometrie-gebaseerde methode voor het onderzoek van de immuun cel samenstelling van muriene aorta. Het grote voordeel van deze methode is de mogelijkheid om aorta immuuncellen analyseren op een enkele cel niveaus en om de activering status van de aorta leukocyten karakteriseren. Deze methode is niet beperkt tot muriene aorta en we (ongepubliceerde gegevens) en anderen ¹⁰ gebruikte deze benadering van de menselijke specimens zoals interne mamma-arterie, aorta-kleppen en kransslagaders te analyseren. Een beperking van deze methode is het relatief lage aantal van muizen aorta leukocyten hersteld single aorta. Terwijl het aantal leukocyten hersteld van een atherosclerotische aorta is voldoende voor een flowcytometrie experiment, kunnen cellen die laag zijn in overvloed zijn moeilijk te detecteren in een aorta celsuspensie. Indien nodig, kan dit probleem worden omzeild door gebruik te maken mengmonsters 2-4 aorta's voor flowcytometrie kleuring. Bovendien, omdat het enzym behandeling kan de uitdrukking van oppervlakte-antigenen beïnvloeden, moet de weerstand tegen enzym behandeling worden bepaald voor alle antigenen van belang. We hebben eerder gevalideerde verschillende antigen markers, die worden beïnvloed door de enzymatische vertering ^7. Moet echter niet geteste antilichaam klonen worden gevalideerd door de onderzoeker alvorens te worden gebruikt in de flowcytometrie experimenten ^7.

Concurrerende adoptieve overdracht homing-test is een krachtige methode om de kinetiek en mechanismen van leukocyten rekrutering te analyseren naar een site van de ontsteking. Wij hebben met succes flowcytometrie analyse van de aorta van de ontvanger muizen toegepast op het mechanisme van migratie van leukocyten te onderzoeken aan de aorta. ⁷ Als u recent verspreidden cellen te analyseren, kan de integratie van broomdeoxyuridine (BrdU) in vivo worden gebruikt als een uitstekende markering voor de prolifererende cellen. Wij deze techniek toegepast met de volgende flowcytometrie analyse om antigeen-specifieke T-cellen te detecteren in de aorta van de ontvanger muizen. ⁷

Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat erop wijst dat de aorta adventitia een belangrijke rol in de atherogenese speelt. Immunohistochemische kleuring van aorta met de omliggende adventitia biedt essentiële gegevens over witte bloedcellen lokalisatie binnen de geanalyseerde weefsels, maar heeft een aantal beperkingen in de gedetailleerde karakterisering van leukocyten subpopulaties. We ontwikkelden een flow cytometrie gebaseerde methode dat de analyse van de aorta en de omliggende adventitia afzonderlijk ⁹ Deze opwindende nieuwe flowcytometrie-gebaseerde techniek het toelaat, in samenwerking met gerenommeerde histologie en moleculair-gebaseerde technieken, zal helpen om mogelijke verschillen in fenotypische en identificeren functionele kenmerken van adventitia en vaatwand wonen leukocyten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
DNase I, type 2	Sigma-Aldrich	D4527
Collagenase I	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase II	Worthington Biochemical	LS004174
Elastase	Worthington Biochemical	LS002292