Summary
Oocyter är benägna att aneuploidi pga fel i kromosomsegregering under meiotiska mognad. Aneuploid ägg kan orsaka infertilitet, missfall eller utvecklingsstörning sjukdomar som Downs syndrom. Här beskriver vi metoder för att presentera material i valet till äggceller och metoder för att studera meiotiska mognad och bedöma ploidi.
Abstract
Misstag i kromosomsegregering leda till aneuploid celler. I somatiska celler är aneuploidi i samband med cancer, men i könsceller leder aneuploidi till infertilitet, missfall eller utvecklingsstörning sjukdomar som Downs syndrom. Haploida gameter form genom artspecifika utvecklingsmässiga program som är kopplade till meios. Den första meiotiska divisionen (MI) är unik för meios eftersom systerkromatider sitta kvar medan homologa kromosomer är segregerade. Av skäl som inte helt klarlagda, är detta reductional division benägna att fel och är mer vanligt källan aneuploidi än fel i meios II (MII) eller än fel i manliga meios 1,2.
Hos däggdjur, oocyter gripandet vid profas av MI med en stor, intakt embryon vesikler (GV, kärnan) och endast återuppta meios när de får ovulatoriska ledtrådar. När meios meritförteckningar, äggceller komplett hjärtinfarkt och genomgå en asymmetrisk celldelning, arresterade igen på metafas av MII. Ägg kommer inte att slutföras MII förrän de befruktas av spermier. Oocyter också kan genomgå meiotiska mognad hjälp av etablerade in vitro odlingsbetingelser 3. Eftersom generation transgena och genprodukter riktade mus mutanter är kostsamt och kan ta lång tid, är manipulation av kvinnliga könsceller in vitro ett mer ekonomiskt och tidsbesparande strategi.
Här beskriver vi metoder för att isolera profas-greps ägg från möss och för mikroinjektion. Allt material val kan föras in i äggcellen, men eftersom meiotically-behörig oocyter är transkriptionellt tysta 4,5 Crna, och inte DNA, måste injiceras för ektopiska uttryck studier. För att bedöma ploidi beskriver vi våra villkor för in vitro-mognad av ägg till MII ägg. Historiskt sett är kromosom-sprida metoder som används för att räkna kromosom nummer 6. Denna metod är tekniskt utmanande och är begränsad till endast identifiera hyperploidies. Här beskriver vi en metod för att bestämma hypo-och hyperploidies med intakta ägg 7-8. Denna metod använder monastrol, en kinesin-5-hämmare, som kollapsar den bipolära spindeln i en monopolär spindeln 9 alltså separera kromosomer så att enskilda kinetochores lätt kan detekteras och räknas med hjälp av en anti-CREST autoimmuna serum. Eftersom denna metod utförs i intakta ägg, är kromosomer inte förlorade på grund av operatörens fel.
Protocol
1. Mus äggcellen samlingen
- För att maximera antalet antral folliklar isolerade från varandra mus, intraperitonealt injicera könsmogna honmöss (vi använder 6-veckor gamla CF-1 möss från Harlan) med 5 IE gravida sto serum gonadotropin (PMSG).
- Förbered samlingen mediet (MEM / PVP) (3 ml / mus) genom att lägga milrinon till 2,5 mikroM och värm vid 37 ° C. Milrinon är en fosfodiesterashämmare som upprätthåller meiotiska gripande gång ägg tas bort från folliklar. Alternativt kan 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (0,2 mm) eller dibutyryl-cykliskt adenosinmonofosfat (dbcAMP) (100 mikrogram / ml) användas. Förbered odlingsmedium genom att lägga glutamin (1 mm) och milrinon (2,5 M) till 1 ml CZB och låt det utjämna i inkubatorn i minst en timme. Ställ in microdrops av varje i en petriskål och overlay med mineralolja. Den CZB skålen placeras i inkubatorn medan MEM / PVP maträtt står utanför på en bild varmare. Andra insamling och odlingssubstrat som är kommersiellt tillgängliga (M2 och M16 från Specialty media eller Sigma) är också rutinmässigt används.
- Cirka 48 timmar efter PMSG grundning, offra musen med CO 2 sedering följt av halsdislokation, dissekera äggstockarna och placera dem i ett klockglas innehåller förvärmda MEM / PVP + milrinon (MEM / PVP + M).
- Använd en 1 ml spruta, ankare äggstockarna till skålen och släpp antral hårsäckarna genom att punktera dem flera gånger med 27-gauge (eller sy) nålar som är fästa vid varandra.
- Samtidigt tittar genom en dissektion mikroskop, samla cumulus-äggcell komplex med en mun som drivs glaspipett. Det är bra att ha ett mikroskop med mycket kontrast. Alternativt kan medium som innehåller vävnader och celler pipetteras på ett lock av plast petriskål. Endast samla in stora, antral folliklar och inte mindre pre-antral folliklar eller utblottad oocyter. När samlas in, överföra komplex till ett microdrop på MEM / PVP + M som är på bilden varmare och under olja.
- Använd en liten pipett (något större än diametern på ägget), pipettera upp och ned i komplex att lossa cumulus celler. Överför utblottad oocyter med en större pipett till en microdrop av CZB + milrinon (CZB + M) och placera i inkubatorn.
- Låt oocyter att återhämta sig i minst 1 timme i inkubatorn före manipulation.
2. Äggcellen mikroinjektion
- Gör injektion pipetter genom att dra i borosilikatglas kapillär rör i en mekanisk avdragare. Vi använder en Flaming-Brown mikropipett avdragare (modell P-97) med följande inställningar: P = 500, Värme = 300, Pull = 150, Vel = 100, Tid = 150.
- Förbered mikroinjektion plattformen genom att placera en 5 l droppe MEM / PVP + M så nära som möjligt till en 0,5 l droppe injektion material val (t.ex. siRNA, Crna, morpholino oligonukleotid, etc.) på en 1-väl kammare bilden som har media kammare bort. Täck med mineralolja och plats på mikroskop scenen (Fig. 1).
- Placera injektion och hålla pipetter i hållarna och position i den droppe av MEM / PVP + M. Slå på kväve tankar som är anslutna till picoinjector och vibrationsdämpande bord. Öppna toppen av injektion pipetten genom att försiktigt knacka den mot att hålla pipetten när du fyller den med medium. Om öppningen är för stor, kommer mediet att flytta in och ut snabbt och nålen kommer att döda cellen. Pipetter med för liten för en öppning täppa ofta lätt.
- Överföring oocyter (5-10) från inkubatorn till MEM / PVP + M droppe på plattformen. Innan injicering, ställa in picoinjector. Vi använder följande parametrar på våra picoinjector (modell PLI-100 från Harvard apparater): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tid = 3s. Detta resulterar i en injektion volym av 5-10 pl.
- Medan du trycker på CLEAR, flytta injektionsnål till materialet sjunker och fylla. Returnera den till mediet droppe.
- Använd hålla pipetten för att fånga en äggcell och anpassa injektionsnål äggcell och hålla pipetten längs x-axeln.
- Under större förstoring, avancera injektionen pipetten genom äggcellen är noga med att undvika kärnan. När membranet är genomborrad, tryck injicera. Efter injektion, ut kanylen. Släpp äggcellen och upprepa. När alla ägg injiceras, återlämna dem till inkubatorn. Håll i CZB + M för önskad tid, denna tid är beroende av den experimentella målet (dvs. siRNA och morpholino ÖVERVÄLDIGANDE (upp till 24 h), överuttryck (3-12 tim)). Observera att inkubationer längre än 24 timmar kommer att kompromissa meiotiska mognad.
3. Äggcellen mognad
- Efter inkubation tvättas oocyter genom flera droppar CZB (mognaden medium) och överför till en microdrop av mognad medel i olja och plats i inkubatorn.
- Låt 16 h för fullständig mognad t o metafas av meios II.
4. Ploidi analys
- Förbered CZB + monastrol (100 M) och placera 750 l i brunnen av ett organ kultur maträtt som har vatten i den yttre ringen.
- Tvätta ägg genom flera droppar CZB + monastrol och överföra dem till orgeln kulturen skålen. Placera i inkubatorn, 1 h.
- Fix äggen genom att överföra dem till ett klockglas innehållande 2% paraformaldehyd i PBS i 20 minuter i rumstemperatur. Överföring till en annan klockglas med blockerande lösningen. Denna maträtt kan lagras vid 4 ° C tills bearbetas.
- Transfer till permeabilization lösning (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN 3) i ett klockglas i 15 minuter i rumstemperatur. Skölj igenom flera stora volymer av blockerande lösningen (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3).
- Resten av proceduren utförs på locket på en 96-brunnar i en fuktig kammare vid rumstemperatur som är skyddad mot ljus. Det droppar (~ 25 l) är placerade inuti den runda fördjupningar. Överföring ägg till blockerande lösningen i 15 minuter.
- Att märka centromerer, överföring ägg till en droppe blockerande lösningen innehåller CREST anti-serum vid 1:40. Inkubera i minst 1 h. Tvätta med 3 droppar av blockerande lösningen, inkubera 15 minuter i varje.
- Överför ägg till en droppe blockerande lösningen innehåller Cy5-eller Alexa-Fluor-594-konjugerat anti-humant IgG (1:200) och inkubera i 1 timme. Upprepa tvätt steg som ovan förutom det sista steget, omfattar Sytox Green (1:5,000) i den blockerande lösningen för att upptäcka kromosomer. Montera i 5 ìl Vectashield. För att förhindra krossning av äggen, satte 4 små fläckar av vaselin i hörnen av där täckglaset kommer att bli. Sätt på ett täckglas ovanpå och tätning med nagellack. Förvaras i en bild ruta vid 4 ° C tills bearbetningen via konfokalmikroskopi.
- Medan avbildning med ett 100X mål, fånga 0,4 ìm steg i Z-planet och bild hela regionen i metafas spindeln. Räkna centromerer använda bildbehandlingsprogram som Bild J (NIH).
5. Representativa resultat:
Figur 2 är en Z-projektion från en euploid ägg. Vid metafas av MII, euploid mus ägg innehåller 20 par kromosomer och därför har 40 centromerer. Ibland kromosomer misslyckas med att sprida trots monastrol behandling. Denna situation gör det svårt att säkert räkna centromerer och vi därför inte inkluderar dessa ägg i våra analyser. Ibland kan det vara svårt att avgöra om en Crest-immunoreaktiva "spot" är ett eller två centromerer. Använda program som Image J är användbart eftersom man kan analysera varje Z-avsnitt medan noggrant notera orientering på kromosomer, hur många avsnitt där en "spot" detekteras och pixel intensitet "spots" har. Beroende där meiotiska spindeln är placerad i förhållande till polära kroppen, kan de regioner av DNA överlappning och dessa prover skall inte ingå i analysen.
Unmanipulated, in vivo ägglossning ägg från reproduktivt unga möss har låga aneuploidi (~ 1-2%). Men av orsaker som inte förstod, mikroinjektion och in vitro mognad förfaranden kan öka denna hastighet uppemot 10%. Därför är det viktigt att kontrollera injicerade ägg ingår i något mikroinjektion studie.
Figur 1. Mikroinjektion maträtt inrättas. En kammare bild med 5 l droppar MEM / PVP + M strax ovanför 0.5μl droppar av injektionslösning. Täck med mineralolja. I detta exempel finns det 3 droppar för 3 olika injektion lösningar och bilden sitter på scenen i ett mikroskop. Till vänster är den mikroinjektion nål och till höger är innehavet pipetten. Observera att det är en återspegling av nålen innehavare.
Figur 2. Ploidi resultat. En Z-projektion av en euploid metafas II ägg. DNA är färgade i grönt och kinetochores är färgade i rött. Pilarna pekar på två distinkta kromatid armar tyder på att kinetochores (# 17 och # 18) överlappar varandra. Euploid mus ägg innehåller 20 kinetochor par (40 totalt "spots"). En aneuploid ägg skulle innehålla någon variant på detta nummer. Om detta förfarande gjordes på metafas MI oocyter, skulle det finnas 40 kinetochor par (80 totalt "spots").
Tabell 1. Recept på insamling och mikroinjektion medium (MEM / PVP + M). Allt material är embryo-kultur klass och från Sigma-Aldrich. Filtrera sterilisera genom 0.22μm PVDF filter (vi använder Milipore Stericups) och förvara vid 4 ° C.
iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tabell 2 "/>
Tabell 2. Recept på CZB medium. Allt material är embryo-kultur klass och från Sigma-Aldrich. Filtrera sterilisera genom 0.22μm PVDF filter (vi använder Milipore Stericups) och förvara vid 4 ° C.
Discussion
Mikroinjektion av oocyter är en kraftfull metod för att studera mekanismer som reglerar meiotiska mognad 10,11, 12, 13. Denna metod ger ett ekonomiskt sätt att testa hypoteser innan du köper en stor investering i att utveckla transgen och riktade musmodeller. Äggcell insamling och tekniker mikroinjektion kräver mer tid att bemästra än vanliga rutiner cellbiologi. Särskilda hinder med samlingen innehåller ofta kontrollera munnen pipett dra rätt Pipettstorlek glas för insamling och strippning av somatiska celler och öka insamlingen hastighet för att minimera den tid som oocyter ligger utanför inkubatorn. Vi rekommenderar att öva många gånger innan de gör experiment. Överföra oocyter mellan microdrops samtidigt som samma antal celler är ett bra sätt att bli bekväm med denna metod.
Celldöd inträffar vanligen under inlärningen mikroinjektion. Detta kan inträffa av flera skäl, bland annat injektion av alltför stor för en mängd material (dvs injektionsnålen öppningen är för stor), slog i kärnan med injektionsnål, piercing motsatta sidan av ägget eller att materialet sprutas är giftigt för i äggcellen. Öva med att injicera bufferten i oocyter tills din överlevnad är minst 50% är nyckeln till att behärska denna teknik. Om oocyter misslyckas med att mogna är det troligt att milrinon inte späddes nog. Vi rekommenderar att skölja oocyter genom många stora droppar milrinon-fri CZB innan mognad.
Den ploidi analyser efter mikroinjektion är en av många analyser för att bedöma meiotiska mognad. Andra rutinanalyser vi använder i laboratoriet omfattar övervakning kinetik genom vilket oocyter framsteg genom meios, immunofluorescens att analysera spindel formation och kromosom inriktning och ägg aktivering eller provrörsbefruktning för att bedöma utvecklingsmässiga konsekvenserna av äggcellen manipulation 14,15, 16, 17.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete utfördes i Richard M. Schultz 's laboratorium. Författarna vill också tacka Michael Lampson för konceptualisering av centromer-räkna analysen och tillgång till hans konfokalmikroskop. Teresa Chiang och Francesca Duncan hjälp med att optimera centromer-räkna-analysen. Paula Stein stöds av HD022681 (till RMS) och Karen Schindler stöds av HD055822.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents: | |||
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
| CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
| Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
| Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Table of specific equipment: | |||
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
| 60 mm Petri Dish | Falcon BD | 351007 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Side warmer | Fisher Scientific | Any standard model | |
| Dissection microscope | Any standard model | ||
| Chamber Slide | Nalge Nunc international | 177372 | |
| Capillary Tubing | Drummond Scientific | 1-000-0500 | microcaps |
| Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Any standard model | |
| Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
| Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
| CO2 tanks | For incubator | ||
| N2 tank | For table and injector | ||
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp. | Any standard model | |
| Incubator | Any standard model | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | Any standard model | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | Any standard model | |
| Humidified chamber | We use tupperware | ||
| Lid of 96 well plate | Nalge Nunc international | 263339 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
| Center well organ culture dish | Fisher Scientific | 353037 | 60 X 15mm |
References
- Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).
- Schultz, M. R. Oogenesis and the control of meiotic maturation. , Cambridge University Press. New York. (1986).
- Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).
- Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).
- Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).
- Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).
- Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).
- Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).
- Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).
- Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).
- Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).
