Summary
Oncolytische virussen zijn veelbelovend voor kankertherapieën. De mogelijkheid om de infectability van levende weefselmonsters van patiënten voorafgaand aan de behandeling vast te stellen is een uniek voordeel van deze therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft hoe te verwerken weefsels voor
Abstract
Oncolytische Virussen (OVS) zijn nieuwe therapieën die selectief repliceren in en doden tumorcellen 1. Verschillende klinische studies ter beoordeling van de effectiviteit van een verscheidenheid van platforms, waaronder oncolytische HSV, reovirus, en Vaccinia OVS als behandeling voor kanker zijn momenteel 2-5. Een belangrijk kenmerk van oncolytische virussen is dat ze kunnen genetisch worden gemodificeerd om reporter transgenen die het mogelijk maakt te visualiseren de infectie van weefsels door microscopie of bio-luminescentie beeldvorming 6,7 uit te drukken. Dit biedt een uniek voordeel, omdat het mogelijk is om weefsels van patiënten ex vivo te infecteren voorafgaand aan de behandeling om de kans op een succesvolle oncolytische virotherapy 8 vast te stellen. Daartoe is het essentieel om adequaat te weefselmonster om te compenseren voor weefsel heterogeniteit en beoordelen van levensvatbaarheid van het weefsel, in het bijzonder voorafgaand aan de infectie 9. Het is ook belangrijk om te volgen met behulp van virale replicatie reporter transgenen als uitgedrukt door de oncolytische platform alsmede door directe titratie van weefsels na homogenisatie om onderscheid te maken tussen mislukte en productieve infectie. Het doel van dit protocol is het aanpakken van deze kwesties en hierin beschrijft een. De bemonstering en de bereiding van de tumor weefsel voor celkweek 2. De beoordeling van de levensvatbaarheid van het weefsel met behulp van de metabole kleurstof Alamar blauw 3. Ex vivo infectie van gekweekte weefsels met vaccinia virus dat zich GFP of vuurvliegluciferase 4. Detectie van transgenexpressie door middel van fluorescentie microscopie of met behulp van een in vivo Imaging System (IVIS) 5. Kwantificering van het virus door plaque assay. Deze uitgebreide methode biedt diverse voordelen, waaronder het gemak van de verwerking van weefsel, de vergoeding voor weefsel heterogeniteit, controle van de levensvatbaarheid van het weefsel, en discriminatie tussen de mislukte besmetting en het bot fide virale replicatie.
Protocol
1. Tissue verwerking
- Voor de beste resultaten, moet dit protocol worden uitgevoerd met vers geïsoleerde tissue gedeponeerd in DMEM medium met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B-oplossing onmiddellijk na een operatie voorafgaand aan de verwerking. Indien dit niet mogelijk is, kunnen weefsels 's nachts worden gelaten in dit medium bij 4 graden voorafgaand aan de verwerking.
- Voorafgaand aan de verwerking van het monster, steriliseren metalen tang en disposable messen door het storten van hen in een 70% ethanol-oplossing gedurende minstens 5 minuten. Ook voorbereiden een 24-wells plaat met 2 ml DMEM medium met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B.
- Verzamel het weefsel monster in een laminaire stroming celkweek kap met behulp van gesteriliseerde pincet en stort het weefsel in een lege 15 cm petrischaal, het houden van de deksel aan de zijkant, steriele kant naar boven.
- In de celkweek kap, gebruik dan een 2 mm biopsie punch om verschillende kernen te verkrijgen uit verschillende regio's binnen het weefsel zoals in figuur 1. Deponeren van de kernen in het deksel van de 15 cm petri met de hulp van de tang, waardoor er voldoende ruimte tussen elke kern, zodat ze gemakkelijk kunnen worden afgesneden langs de horizontale as.
- Split elke kern in de vier kwartalen zelfs met behulp van een gesteriliseerd scheermesje zoals in figuur 1.
- Met behulp van een pipet tip, zet elke kern kwartaal van een bepaalde kern in een ander goed van A1 tot A4 als in figuur 1, die reeds met 1,5 ml DMEM met 10% FBS, 1% Pennicilin / Streptomycine oplossing, en 0,1% Amphothericin B-oplossing . Herhaal dit voor elke kern. Dit moet het mogelijk maken een representatieve steekproef van de tumor, terwijl het minimaliseren van bias in een gegeven goed / conditie. Voor een betere vertegenwoordiging, toename van het aantal cores.
2. Beoordeling van de levensvatbaarheid van het weefsel
- Na de verwerking van weefsel, toe te voegen 25μl Alamar blauw goed # A1 en A2 # zoals weergegeven in figuur 1 en incubeer gedurende 1 uur bij 37 graden in een vochtige incubator met 5% CO 2.
- Na incubatie met Alamar blauw, verwijder dan 3 maal 100 pi van elk A1 en A2 goed en transfer naar 6 verschillende wells van een 96-wells plaat. Lees het signaal met behulp van een fluorescentie plate reader (530 excitatie, 590 emissie) en bewaar de gegevens voor uw eigen administratie.
- Na Alamar blauwe signaal is gelezen, overdracht alle stukjes weefsel met behulp van een pipet tip, uit goed A1 naar C1 dat bevat DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Wees voorzichtig dat u een overmatige hoeveelheid media overdracht van goed A1.
- Respectievelijk infecteren putten A3 en A4 met 10 6 PFU van GFP-expressie en de luciferase-expressie vaccinia virus verdund in 25 ul van de media. Goed A2 kunnen worden geïnfecteerd met een virus dat elk transgen drukt ook helemaal geen.
- 72 uur later, voeg 25 ul Alamar blauw om putten C1 en D1 en herhaal stap 2.2
3. Visualisatie van GFP transgen expressie door bloei microscopie
- Verwijder alle celcultuur media die het weefsel stukken om een goede fluorescentie foto's te maken.
- Met behulp van een fluorescentie-microscoop in staat is dissectie, eerst een fase contrast beeld op een geschikte resolutie
- Schakel over naar fluorescentie-modus en maak een foto met de juiste filter op het transgen van belang te visualiseren, in dit geval GFP.
- Gebruik een fluorescentie-filter voor een andere golflengte zo ver mogelijk een van die van het transgen van belang (zoals RFP) om een beeld te krijgen van achtergrond fluorescentie te nemen
4. Visualisatie van luciferase expressie met behulp van een in vivo beeldvorming System (IVIS)
- Zorg ervoor dat de IVIS is geïnitialiseerd voordat u begint.
- In putten A4 en B4, voeg 5 pl luciferine substraat 10 mg / ml, goed mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Stel de IVIS belichtingstijd tot 5 seconden en neem een foto van uw putten. Als het beeld verzadigd is, herhaal dan met een lagere belichtingstijd. Als er geen signaal, verhoging van de belichtingstijd.
- Met behulp van de IVIS imaging software, kunt u verwijderen achtergrond met behulp van het signaal van goed B4 en selecteer de regio van belang zijn voor de luminescentiesignaal kwantificeren.
5. Het beoordelen van virale titers door plaque assay
- Voorafgaand aan het kwantificeren van virale titers, moet eerst worden gehomogeniseerd weefsel aan virale deeltjes vrij te geven. Dit kan enkele maanden later worden gedaan in het geïnfecteerde weefsel monsters worden bewaard bij -80
- Weeg het monster dat moet worden gehomogeniseerd met behulp van een analytische schaal. In dit geval zullen we gebruik maken van de monster van goed A2.
- Leg het weefsel is in een 5 ml polystyreen ronde bodem falcon buis en voeg 1 ml PBS. Homogeniseer de weefsel met behulp van een tissue homogenisator. Indien nodig, op te slaan de homogenaat bij -80 voor de beoordeling van de virale titers op een later tijdstip.
- Om titer vaccinia virus, eerste plaat miljoen U2OS cellen in een 6-wells plaat en overnachting in een 37 graden incubeer 5% CO 2 vochtigeified incubator zodanig dat ze ongeveer 95% confluentie bereikt de volgende dag.
- Gebruik serum vrije media op de seriële verdunningen van het virus te doen, zorg ervoor dat u tips tussen elke verdunning stap te wijzigen. Normaal gesproken doen we 1 op de 10 verdunningen en gebruik van 100 ul om te zetten in 900 ui. Hoeveel verdunningen worden gemaakt hangt af van de te verwachten opbrengst virus.
- Na het maken van de verdunningen, verwijder de media die de vergulde U20S cellen dan 500 ul van de verwaterde virus voorraad (voor elke verdunning) toe te voegen aan de U2OS cellen te infecteren. Incubeer de cellen gedurende 1 uur minuten bij 37 graden Celsius in een 5% CO 2 bevochtigde incubator.
- Gedurende deze tijd, warming-up van de 2 X geconcentreerde DMEM met 20% FBS, en de 3% CMC-oplossing in een 37 graden water bad.
- Na 1 uur incubatie, verwijder de media die geïnfecteerde U2OS cellen. Samen 2X DMEM, 20% FBS en gebruik 2 ml van dit mengsel aan elke well van de geïnfecteerde cellen U2OS cover: mix 1:01 volumes van 3% CMC.
- Leg cellen in een 37 graden 5% CO 2 vochtige incubator voor een ander 48 uur.
- Na 48 uur, voeg 2 ml methanol-azijnzuur fixatief op de top van de CMC overlay in elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een celcultuur kap.
- Gooi de vaste overlay en was rest off van de putten gebruik van leidingwater.
- Vlekken op de vaste U2OS cellen met 2 ml van een Coomassie blauwe oplossing per putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op lage snelheid op een bord shaker.
- Haal de Coomassie vlek van de putten en spoel de platen met behulp van leidingwater. Laten drogen met deksel af voor ongeveer een uur.
- De resulterende virale plaques kan eenvoudig worden gevisualiseerd in figuur 2C. Platen kunnen onbeperkt worden bewaard in dit stadium.
- Tel plaques op de verdunning stap waar tussen 10 en 100 plaques zichtbaar zijn.
- Vermenigvuldig het aantal plaques geteld door de gebruikte verdunning en vermenigvuldig het resulterende getal met 2 tot een titer in PFU / ml te geven. Bijvoorbeeld, als 25 plaques worden meegeteld in de put, waar een miljoen-voudige verdunning werd gebruikt, de titer van de initiële onverdunde monster wordt 25 vermenigvuldigd met 1 miljoen vermenigvuldigd met 2 of 50 miljoen PFU / ml. Verder dit nummer in eerste instantie te delen door het gewicht te meten om het monster titers rapport PFU / g
6. Representatieve resultaten:
Om nauwkeurig te kunnen bepalen of een chirurgisch verkregen normaal / tumorweefsel monster is of niet is geïnfecteerd met een virus, moet men eerst voor zorgen dat het weefsel monster wordt op zijn minst levensvatbaar is. Fig. 1A laat zien dat levensvatbaarheid ervan kan worden beoordeeld met behulp van een metabole kleurstof (Alamar blauw) en dat zowel de normale en tumor weefsel kan metabolisch actief blijven gedurende een periode van ten minste 72 uur. Dit suggereert dat weefsel gekweekte ex vivo kunnen ondersteunen virale replicatie. Een belangrijk voordeel van oncolytische virussen is dat ze kunnen worden gemanipuleerd om therapeutische of imaging transgenen uit te drukken. Fig. 2D-E laat zien dat GFP of Luciferase kan worden gedetecteerd uit de weefsels geïnfecteerd ex vivo, verder ondersteunen dat deze weefsels zijn levensvatbaar en ook geïnfecteerd. Hoewel de verhoogde transgen expressie is over het algemeen geassocieerd met virale replicatie, is het niet noodzakelijkerwijs gelijk aan een productieve virale levenscyclus die leidt tot zelf-versterking en de verspreiding, waarvan men denkt belangrijk te zijn voor therapeutische activiteit. Om deze reden is het noodzakelijk om te bepalen of meer virus wordt geproduceerd dan wat werd gebruikt om in eerste instantie infecteren het weefsel. Fig 2B toont dat bij virale kwantificering van plaque assay, meer virus wordt verkregen na 72 uur infectie dan weefsel verzameld direct na de infectie. Het geheel genomen, deze gegevens laten zien dat chirurgisch weggesneden tumor weefsel kan mogelijk blijven in cel cultuur voor een periode van ten minste 72 uren, gedurende welke tijd de virale replicatie kan worden ondersteund.
Figuur 1. Overzicht van de weefsel bemonstering / snijden protocol. Weefsel wordt verwerkt door het verwijderen van een aantal 2 mm cores die vervolgens zijn onderverdeeld in vier kwart, die willekeurig zijn verdeeld in putten A1-A4. De kleurcodes geven de reagentia die worden gebruikt in elk putje. De grijs-schaduwrijke pleinen binnen de putjes zijn elk kwartaal van de zes afgebeelde afzonderlijke kernen. Het weefsel in een goed A1 wordt overgedragen aan een nieuwe put (C1) met de media na de eerste Alamar blauwe lezen. Een tweede lezing wordt gedaan aan het eind van de 72 uur incubatie met virussen. Wells A4 en B4 worden aangevuld met Luciferine na de 72 uur incubatie post-infectie
Figuur 2. Levensvatbaarheid en infectability van de patiënt weefselmonsters. A) Tissue levensvatbaarheid zoals gemeten door Alamar blauw signaal op 2 uur en 72 uur na collectie. Y-as staat voor de blanco gecorrigeerde Alamar blauw signaal. B) titer van vaccinia virusverzameld per gram van weefselmonsters 2 en 72 uur na de infectie. C) Voorbeeld van vaccinia virus plaques op U2OS cellen na Coomassie kleuring. D) luminescentiesignaal verkregen van de patiënt VV-luciferase-geïnfecteerd weefsel beeld gebracht met behulp van IVIS. E) Fluorescentie microscopie foto's van de patiënt weefselmonster geïnfecteerd met VV-GFP.
Discussion
Een van de kritische stappen in dit protocol is het verkrijgen van verse weefselmonster. Als het monster wordt in celcultuur na een lange wachttijd op de operatiekamer in een ongeschikte media (bijv. PBS), kan dit compromis levensvatbaarheid van het weefsel en het voorkomen van infectability. Van de nota, normale weefsel is inherent gevoeliger voor deze effecten dan de tumor weefsel. Een ander kritisch punt is hoeveel cores worden gebruikt om het weefsel en de consistentie van hun grootte steekproef. Inconsistenties in omvang zal leiden tot variabiliteit tussen patiënten monsters, omdat factoren zoals weefselhypoxie en infectectable oppervlakte zal fluctueren afhankelijk van de grootte van de kernen en de kern kwartalen. Hoewel dit kan gedeeltelijk worden opgelost door met behulp van weefsel snijmachines, een voordeel van de hier gepresenteerde methode is dat het relatief eenvoudig is, minder vatbaar voor besmetting, en breed toepasbaar op een verscheidenheid van weefsels soorten, waaronder zachte of viskeuze weefsels die niet gemakkelijk vatbaar aan weefsel snijden. Met name kan het aantal cores worden verhoogd om een betere vertegenwoordiging weefsel te krijgen. Ook kan de kernen worden gesneden in meer stukken (bijv. 5-8) naar andere potentiële assays geschikt voor parallel worden uitgevoerd, zoals DNA, RNA of eiwit extractie. Echter, het aantal stuks, waarin de kernen kan worden teruggebracht tot reproduceerbare maten zijn afhankelijk van de werkelijke grootte van de kernen, die kan worden aangepast door gebruik te maken van verschillende grootte corers. Optioneel, een manier om hulp te verkrijgen reproduceerbaar grote weefsel stukken is om zelfs de lengte van de kernen met behulp van een liniaal voorafgaand aan verdere onderverdeling ze in kleinere stukken. Het protocol kan natuurlijk aangepast worden om andere virussen te vangen en we hebben gemerkt dat weefsels kunnen levensvatbaar is en de ondersteuning replicatie voor maximaal 6 dagen. Het protocol kan verder worden uitgebreid tot metingen van andere viraal uitgedrukt transgenen inclusief cytrokines. Na infectie, kunnen weefsels ook worden ingebed in paraffine voor verdere snijden en vlekken door immunohistochemische methoden, die zorgt voor een verdere verfijning van het weefsel histologie en de manier waarop deze betrekking heeft op virale infectie 10-12.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr Hesham Abdelbary bedanken voor het aanbieden van menselijke chirurgische exemplaren voor de gegevens die in figuur 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | GIBCO, by Life Technologies | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex Inc. | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica Microsystems | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec Products | model 985370-395 |
References
- Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer. Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).
- Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck. Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).
- Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. Reovirus: Rationale and clinical trial update. Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).
- Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 85-89 (2010).
- Boeuf, F. L. e Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther. 18, 888-895 (2010).
- Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).
- Diallo, J. S. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
- Cooke, S. L. Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer. Br J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses. J Surg Res. , 1-6 (2010).
- Hochberg, M. Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers. Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Kuip, H. vander Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).
